Não há nada mais frustrante para um cromatografista do que chegar no dia seguinte em frente do seu HPLC e perceber que aquela sêquencia colocada pra rodar no dia anterior foi perdida.
Não importa se era um teste, 5 lotes de produto final, estabilidade ou uma validação de método, aquele instante da descoberta é frustrante e a única coisa que queremos saber é o que causou o problema.
Em geral procuramos por erros grandes para justificar o problema: uma coluna saturada, uma fase móvel preparada errada ou um defeito no equipamento.
Mas na maioria das vezes não encontramos o tal “problema”, e dependendo do nível de compliance da empresa em que você atua, alguns dias serão perdidos tentando justificar o erro, sem encontrar o real motivo para o problema.
O que muitos usuários de cromatografia líquida ainda não perceberam é que em geral, este “problema” grande que estamos procurando nada mais é do que a somatória de pequenos erros gerados na nossa rotina de preparação do sistema HPLC para aquela análise.
Nos próximos p
osts iremos tratar em detalhes quais são os cuidados que os cromatografistas experientes
utilizam em sua rotina para garantir uma rotina produtiva e confiável.
Degaseificação: a degaseificação é com certeza um dos pontos mais sensíveis quando tratamos de se manter uma rotina analítica eficiente e produtiva. Muitos ignoram a importância deste fator nos dias atuais, graças a grande eficiência dos degaseificadores em linha que existem hoje nos sistemas HPLC / UHPLC, mas isso não elimina o risco de problemas com bolhas.
Como funciona um degaseificador em linha: basicamente no caminho fluídico do seu HPLC há um pequeno tubo plástico permeável à gás dentro de uma pequena câmara onde é aplicado vácuo; como este tubo é bastante fino, ele apresenta uma boa área de contato e por diferença de pressão, o gás dissolvido ou pequenas bolhas são forçadas a permearem o tubo e saírem da sua fase móvel.
O que acontece quando uma bolha de ar passa pra dentro do sistema HPLC: há muitas possibilidades quando tentamos imaginar como a bolha se comporta dentro do sistema HLPLC. Bolhas grandes podem causar grande oscilação da pressão, o que em alguns sistema mais modernos causará o interropimento do fluxo; se você tiver sorte, ela pode apenas causar uma oscilação no fluxo e pressão, oque inevitavelmente causará algum efeito na cromatografia. Se esta bolha passar no sistema no momento da injeção, ela pode ocupar um determinado volume dentro do loop de amostragem, o que causará problemas de reprodutibilidade. Enquanto passa pela coluna, a bolha tende a ficar em solução, mas não elimina a possibilidade de alguma interação com a separação cromatográfica.
Mas ao sair da coluna, a pressão do sistema volta a ficar próxima a pressão ambiente e a bolha reaparece, podendo causar picos ou distúrbios de linha de base. Micro bolhas irão se apresentar como um ruído constante de linha de base, facilmente observável para quem já conhece a cromatografia daquele método / análise específica.
O oxigênio dissolvido na solução é mais grave para alguns tipos de detecção, como na fluorescência (supressão ou atenuação de alguns compostos), detectores de índice de refração ou para os detectores eletroquímicos em modo redutor.
Dicas práticas:
- faça a degaseificação dos seus solventes para HPLC com vácuo e ultrassom (método mais efetivo) por 10 min;
os canais;
observar a presença de bolhas ou micro bolhas.
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