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Welch / Chromastore Traduzido por Ronaldo Buissa Netto
Vantagens e FAQ`s da cromatografia de
interação hidrofílica (HILIC)
A cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) pode ser considerada como cromatografia de fase normal usando uma fase móvel aquosa-orgânica, por isso às vezes é chamada de “cromatografia de fase normal aquosa”. A coluna HILIC é mais polar do que a coluna de fase reversa, e a água, solvente altamente polar, é usada como solvente forte. Aumentar a proporção de água reduz a retenção da amostra (ao contrário da cromatografia de fase reversa). Solutos mais polares e ionizados são mais retidos no HILIC. Na maioria das separações HILIC, a proporção de água na fase móvel está entre 3% e 40%. Quando a proporção de água é superior a 40%, a retenção é geralmente fraca.
Fase Estacionária
As fases estacionárias usadas rotineiramente na
cromatografia HILIC incluem: coluna de sílica pura, coluna amino, coluna amida,
coluna zwitterion, etc. As colunas de sílica pura têm a vantagem de “sangrar”
menos e são mais populares ao usar detectores CAD, ELSD e LC-MS . As colunas de
aminoácidos, usadas na cromatografia HILIC, são particularmente adequadas para
a separação de carboidratos (sacarídeos). A coluna zwitteriônica não precisa
mais usar reagentes de pareamento iônico (PICs), tem forte hidrofilicidade e
pode efetivamente reter moléculas básicas / compostos iônicos polares fracos ou
não retidos na cromatografia de fase reversa.
Diferente das colunas de sílica e amino usadas na
cromatografia de fase normal, as colunas HILIC podem ser usadas com fase móvel
orgânica / aquosa. Essa resistência à água da coluna HILIC é muito importante
ou então teremos problemas com alto nível de ruído de linha de base e vida útil
curta da coluna devido à hidrólise da fase estacionária. Portanto, as colunas
usadas na cromatografia de fase normal podem não ser necessariamente usadas na
cromatografia HILIC. O contrário é possível: colunas adequadas para
cromatografia HILIC podem ser usadas em cromatografia de fase normal.
Vantagens da HILIC
Os solutos polares são preferencialmente retidos em HILIC, o
que significa que muitas substâncias que são pouco retidas na cromatografia de
fase reversa podem ser facilmente separadas usando HILIC.
A cromatografia de interação hidrofílica tem várias
vantagens potenciais:
● Bom formato de pico para solutos básicos
● Ajuda a melhorar a sensibilidade da espectrometria de
massa
● Injeção direta de amostras dissolvidas em solventes
orgânicos
● Pode suportar fluxos mais altos devido à menor viscosidade
da fase móvel
Perguntas frequentes sobre o HILIC
Em comparação com a cromatografia de fase reversa, o
problema mais comum na cromatografia de interação hidrofílica é provavelmente o
formato de pico abaixo do ideal (cauda ou cauda frontal). Isso reflete o fato
de que a técnica de separação por HILIC ainda não é amplamente utilizado como a
cromatografia de fase reversa. As colunas HILIC ainda podem usar sílica tipo A como
material de suporte / fase estacionária. Também precisamos continuar a melhorar
as colunas HILIC e encontrar maneiras de melhorar o formato de pico.
Ao encontrar problemas de formato de pico, a primeira coisa a
se tentar deve ser o aumento da
concentração do tampão na fase móvel. Algumas amostras requerem concentrações
de tampão de até 100 mmol/L para obter um bom formato de pico. Em geral, a
amostra deve ser dissolvida na fase móvel, mas às vezes, para melhorar o formato
de pico, a proporção do solvente orgânico usado para dissolver a amostra pode
ser aumentada. Se o formato do pico ainda não melhorar, considere substituir a
coluna ou ajustar o pH da fase móvel. A fase móvel deve sempre conter uma certa
quantidade de água e a proporção de água deve ser de pelo menos 3% a 5%.
