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Welch / Chromastore   Traduzido por Ronaldo Buissa Netto

 

Vantagens e FAQ`s da cromatografia de interação hidrofílica (HILIC)

A cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) pode ser considerada como cromatografia de fase normal usando uma fase móvel aquosa-orgânica, por isso às vezes é chamada de “cromatografia de fase normal aquosa”. A coluna HILIC é mais polar do que a coluna de fase reversa, e a água, solvente altamente polar, é usada como solvente forte. Aumentar a proporção de água reduz a retenção da amostra (ao contrário da cromatografia de fase reversa). Solutos mais polares e ionizados são mais retidos no HILIC. Na maioria das separações HILIC, a proporção de água na fase móvel está entre 3% e 40%. Quando a proporção de água é superior a 40%, a retenção é geralmente fraca.

Fase Estacionária

As fases estacionárias usadas rotineiramente na cromatografia HILIC incluem: coluna de sílica pura, coluna amino, coluna amida, coluna zwitterion, etc. As colunas de sílica pura têm a vantagem de “sangrar” menos e são mais populares ao usar detectores CAD, ELSD e LC-MS . As colunas de aminoácidos, usadas na cromatografia HILIC, são particularmente adequadas para a separação de carboidratos (sacarídeos). A coluna zwitteriônica não precisa mais usar reagentes de pareamento iônico (PICs), tem forte hidrofilicidade e pode efetivamente reter moléculas básicas / compostos iônicos polares fracos ou não retidos na cromatografia de fase reversa.

Diferente das colunas de sílica e amino usadas na cromatografia de fase normal, as colunas HILIC podem ser usadas com fase móvel orgânica / aquosa. Essa resistência à água da coluna HILIC é muito importante ou então teremos problemas com alto nível de ruído de linha de base e vida útil curta da coluna devido à hidrólise da fase estacionária. Portanto, as colunas usadas na cromatografia de fase normal podem não ser necessariamente usadas na cromatografia HILIC. O contrário é possível: colunas adequadas para cromatografia HILIC podem ser usadas em cromatografia de fase normal.

 

Vantagens da HILIC

Os solutos polares são preferencialmente retidos em HILIC, o que significa que muitas substâncias que são pouco retidas na cromatografia de fase reversa podem ser facilmente separadas usando HILIC.

A cromatografia de interação hidrofílica tem várias vantagens potenciais:

● Bom formato de pico para solutos básicos

● Ajuda a melhorar a sensibilidade da espectrometria de massa

● Injeção direta de amostras dissolvidas em solventes orgânicos

● Pode suportar fluxos mais altos devido à menor viscosidade da fase móvel

 

Perguntas frequentes sobre o HILIC

Em comparação com a cromatografia de fase reversa, o problema mais comum na cromatografia de interação hidrofílica é provavelmente o formato de pico abaixo do ideal (cauda ou cauda frontal). Isso reflete o fato de que a técnica de separação por HILIC ainda não é amplamente utilizado como a cromatografia de fase reversa. As colunas  HILIC ainda podem usar sílica tipo A como material de suporte / fase estacionária. Também precisamos continuar a melhorar as colunas HILIC e encontrar maneiras de melhorar o formato de pico.

Ao encontrar problemas de formato de pico, a primeira coisa a se tentar deve ser o aumento  da concentração do tampão na fase móvel. Algumas amostras requerem concentrações de tampão de até 100 mmol/L para obter um bom formato de pico. Em geral, a amostra deve ser dissolvida na fase móvel, mas às vezes, para melhorar o formato de pico, a proporção do solvente orgânico usado para dissolver a amostra pode ser aumentada. Se o formato do pico ainda não melhorar, considere substituir a coluna ou ajustar o pH da fase móvel. A fase móvel deve sempre conter uma certa quantidade de água e a proporção de água deve ser de pelo menos 3% a 5%.

Algumas colunas de fase ligada apresentam sangramento de fase estacionária quando analisando com detecção de massa (MS). A solução mais simples é usar uma coluna de sílica ou coluna de fase ligada diferente. Tem sido apontado na literatura que, ao usar a cromatografia de interação hidrofílica, alguns componentes da amostra irão se ligar irreversivelmente à coluna de sílica. Neste caso, uma coluna HILIC de fase ligada pode ser considerada.