P1:
O que fazer para alterar a seletividade na cromatografia líquida ?
R:
Fase móvel
- O tipo e a proporção de solventes
orgânicos na fase móvel afetarão a seletividade da separação cromatográfica.
Para o modo de cromatografia de fase reversa, os solventes orgânicos comumente
usados são metanol, acetonitrila e tetrahidrofurano. A seletividade e a
resolução podem ser alteradas alterando o tipo de fase orgânica na fase móvel
ou ajustando sua proporção.
- O valor de pH da fase móvel afeta a
resolução. Para compostos neutros, mudanças no pH da fase móvel não terão muito
impacto em sua seletividade; para compostos ácidos e compostos básicos
(compostos dissociáveis), o impacto é maior.
- A força iônica da fase móvel pode
ser ajustada pela adição de sais tampão para melhorar a retenção entre o
composto alvo e a fase estacionária.
Fase estacionária
O tipo de fase ligada, o tamanho do
poro da partícula, o tipo de capeamento, o tamanho da partícula e o tamanho da
coluna cromatográfica afetarão os resultados da separação cromatográfica. O
fator mais importante é a seleção da fase estacionária. Quando você não
consegue obter bons resultados de separação com a fase estacionária C18, você
pode considerar a fase estacionária C8 com forte polaridade, ou a coluna
fenil-hexil com grande diferença de seletividade.
Sistema cromatográfico
Ajustar alguns parâmetros do sistema
cromatográfico também pode melhorar os resultados da separação cromatográfica
até certo ponto. Por exemplo, taxa de amostragem mais alta no seu detector; uma
tubulação de diâmetro interno menor e uma célula de fluxo menor são usadas para
reduzir o volume de difusão e o volume de atraso e reduzir o alargamento dos
picos cromatográficos; Ou melhore a resolução aumentando a temperatura da
coluna cromatográfica.
P2:
E se a área do pico da amostra ficar menor ?
R:
1. Se a resposta de todos os
componentes mudou aproximadamente na mesma medida, temos algumas possibilidades
- Problema de injeção: verifique o
vial de amostra e a agulha de injeção para garantir que a concentração da
amostra e o volume de injeção não mudaram.
- Problema no detector: verifique
todas as configurações de parâmetros do detector. Se o ruído da linha de base
for grande, geralmente não é o detector, mas o sistema cromatográfico está
contaminado.
- Se o composto de interesse é estável
e pode se degradar durante a injeção / análise.
- Se as condições cromatográficas
mudaram, como fluxo de fase móvel, valor de pH, etc.
- Quando a coluna cromatográfica muda,
a seletividade muda e a resposta do detector também muda.
2. Apenas alguns compostos apresentam
resposta diminuída
- Verifique se eles têm volatilidade
ou grupos funcionais semelhantes. Para compostos quimicamente diferentes, o
olhar é diferente: amostras com grupos funcionais polares (como – OH, – NH, –
SH) são fáceis de serem adsorvidas por uma coluna contaminada, justificando o
problema de diminuição de resposta.
- Se as propriedades físico-químicas
desses componentes são estáveis e se ocorre degradação no processo de injeção
/ análise.
P3:
Quando a mesma amostra é injetada repetidamente, por que a área do pico varia ?
R:
Há muitas razões para este resultado:
- Se a amostra for estável, primeiro
elimine a falha do instrumento: bolhas é o problema mais comum, a formação de
bolhas altera o volume injetado em cada replicata.
- Se as concentrações variarem muito
entre as amostras e a área do pico do composto de interesse permanecer
constante após 2-3 injeções, pode ser resíduo de amostra ficando na coluna.
- A diminuição da área do pico também
pode ser causada pela variação de temperatura, mas o efeito é muito pequeno,
inferior a 2%. Se você retirar a amostra da geladeira e colocá-la no
amostrador, a variação de densidade da amostra depois de atingir a temperatura
ambiente causará a variação de resposta.
- A mudança aleatória da velocidade do
fluxo também levará à mudança da área do pico. Outra causa potencial de
mudanças na taxa de fluxo é o vazamento na parte pressurizada do sistema
cromatográfico, que deve ser fácil de detectar.
- Amostras complexas podem apresentar
grupos de picos de difícil separação (pares complexos) e podem dificultar para
o software determinar onde está a linha de base. Utilize sempre os mesmos
valores / limites para os parâmetros do software de integração para melhor a
reprodutibilidade da integração. A própria amostra também causa a alteração da
área do pico. Na cromatografia de fase reversa, algumas proteínas não são
completamente eluidas no gradiente inicial e os resíduos aparecem no gradiente
da injeção de branco seguinte. Esses picos fantasmas estão presentes apenas em
proteínas específicas e procedimentos de eluição específicos. Em caso
afirmativo, adicione um branco após analisar a amostra. Além disso, as
proteínas adeririam irreversivelmente a algumas colunas, e a área do pico da
amostra aumentaria gradativamente com o aumento da injeção da amostra.
P4:
Flutuação de pressão, como ter pressão “estável” no sistema cromatográfico ?
R:
A flutuação de pressão é um problema comum no trabalho diário. De um modo
geral, a relação entre flutuação de pressão e coluna cromatográfica não é
grande, mas o maior suspeito desse problema é o sistema HPLC. Os 2 pontos a
seguir merecem atenção:
- Existem bolhas na bomba;
- Vazamento da válvula de retenção
(check valves) ou selos.
As soluções são as seguintes:
- Desgaseificação ultrassônica após /
durante a filtração do solvente;
- Use desgaseificador on-line (a
maioria dos sistemas HPLC`s atuais já possuem sistema de degaseificação online
integrado ou como opcional);
- Purge seu sistema HPLC para a
retirada das bolhas de sua fase móvel;
- Limpe e / ou substitua a válvula de
retenção;
- Substitua os selos da bomba.
P5:
Como armazenar a coluna HPLC corretamente?
R:
1. Para períodos curtos de
armazenamento (2-3 dias):
Coluna de fase reversa: caso utilize
tampão ou fase móvel contendo sais, após a conclusão do experimento, use 20-30
volumes de coluna de uma mistura 10:90 de ACN:H2O ou MeOH:H2O para a lavagem.
Use uma mistura 90:10 de ACN:H2O ou MeOH:H2O por mais 10 a 20 volumes de coluna
para a lavagem final. Se for necessário armazenamento durante a noite, a taxa
de fluxo pode ser mantida em 0,1 a 0,2 mL/min.
Coluna de fase normal: Lave a amostra
com a fase móvel, depois enxágue a coluna com uma alta proporção de
n-hexano:isopropanol e armazene-a.
2. Para períodos longos de
armazenamento, a coluna deve ser armazenada em solvente adequado. A coluna de
fase reversa pode ser armazenada em metanol puro ou acetonitrila, a coluna de
fase normal pode ser armazenada em n-hexano puro após desidratação estrita e a
coluna de troca iônica pode ser armazenada em água (contendo o conservante
azida de sódio ou timerosal). Sempre conecte firmemente os plugs cegos nas
extremidades da coluna para evitar evaporação do solvente. Para armazenamento
de colunas cromatográficas especiais, consulte as instruções da coluna e use os
solventes recomendados pelo fabricante.
P6:
Meu pico cromatográfico está demorando para sair, como resolver isso?
R:
1. Redução / problemas no fluxo de
fase móvel
- Verifique e reajuste o fluxo;
- Verifique se há bolhas na bomba /
caminho fluídico;
- Verifique se há vazamento na válvula
de retenção (check valve), nos selos da bomba ou outros componentes do sistema
fluídico pressurizado.
2. Alteração da composição da fase
móvel
- Verifique se há pontos de vazamento
de líquido no sistema;
- Remova as bolhas do sistema;
- Reabasteça o(s) frasco(s) de
solvente(s);
- Certifique-se de que seu gradiente
está corretamente programado;
- Verifique se você está utilizando a
fase móvel pré-misturada ou misturando pelos canais da bomba;
- Composição da fase móvel. Na
cromatografia de fase reversa, o fator de retenção K está exponencialmente
relacionado à proporção de fase orgânica na fase móvel. Se sua composição de
fase mudar 1%, seu tempo de retenção pode mudar algo entre 5 – 15%. Uma mudança
de pH de 0,1 levará a uma mudança de tempo de retenção de 10%, portanto, o pH deve
ser medido com precisão e o pHmetro deve ser calibrado. Na cromatografia de
fase reversa, com o aumento do pH, o tempo de retenção de compostos ácidos será
encurtado e o de compostos alcalinos será prolongado;
- A concentração do reagente de
pareamento iônico afetará o tempo de retenção dos componentes do composto
iônico. O tempo de retenção de analitos com carga oposta ao reagente do par
iônico será reduzido e aqueles com a mesma carga serão prolongados;
- O tempo de retenção da cromatografia
de fase normal é muito sensível aos componentes polares na fase móvel. Em
qualquer caso, a água é um problema.
3. Perda de fase ligada
- Para colunas cromatográficas de
sílica tradicional, mantenha a fase móvel entre pH 2 - 8;
- Para pH muito alto (> 10) ou pH muito
baixo (< 2), use coluna de fase estacionária de alta estabilidade (1,5 – 12)
ou colunas com base polimérica de alta estabilidade.
4. Sítios ativos na sílica
Modificadores de fase podem ser
utilizados para competir com os compostos e diminuir a interação de seus
compostos de interesse com os sítios ativos. A melhor solução é o uso de
colunas com maior cobertura (carga de carbono).
5. Redução de temperatura
Geralmente, o tempo de retenção muda
de 1% a 2% para cada mudança de 1 ℃ na temperatura. Geralmente, o impacto não é
tão grande. Obviamente, esse problema pode ser evitado usando um forno de
coluna.
P7:
Como resolver o problema de diminuição do tempo de retenção de picos
cromatográficos ?
R:
1. Sítios ativos no empacotamento da
coluna cromatográfica
Use modificadores de fase móvel para
competir com álcalis (compostos básicos como trietilamina) ou aumente a força
do tampão. O uso de colunas de alta cobertura é uma solução.
2. Alteração da composição da fase
móvel
- Verifique se há pontos de vazamento
de líquido no sistema;
- Remova as bolhas do sistema;
- Reabasteça o frasco de solvente;
- Certifique-se de que seu gradiente
esteja corretamente programado;
- Verifique se você está utilizando a
fase móvel pré-misturada ou misturando pelos canais da bomba.
3. Sobrecarga de amostra
Reduza o tamanho da amostra, use um
diâmetro interno maior ou uma coluna mais longa.
4. Perda de fase ligada ou base de
sílica
- Use uma fase móvel de pH suave
(3-8);
- Use colunas especiais de sílica,
colunas poliméricas ou colunas resistentes à pH`s extremos.
5. Coluna cromatográfica velha
Use colunas de guarda ou colunas
poliméricas / híbridas de alta estabilidade.
P8:
Como verificar se a oscilação da linha de base afeta o resultado das minhas
amostras ?
R:
1. Se a coluna não estiver equilibrada
com a composição de fase móvel, isto resultará em oscilação da linha de base;
2. Para instrumentos sem
desgaseificador em linha, quando a fase móvel não estiver completamente
desgaseificada, aparecerão distúrbios na linha de base;
3. Quando a coluna cromatográfica
estiver suja / contaminada, também causará flutuação da linha de base;
4. A célula de fluxo do detector está
suja, resultando em absorção instável. Neste momento, as janelas da célula de
fluxo precisam ser limpas;
5. Quando a energia da lâmpada do
detector é insuficiente, a absorção se tornará instável e a linha de base
geralmente é instável, especialmente em baixos comprimentos de onda;
6. O comprimento de onda de corte da
fase orgânica na fase móvel deve ser preferencialmente menor que o comprimento
de onda de detecção em mais de 20 nm;
7. O ambiente do laboratório é
instável (como aumento e diminuição da temperatura, mudança do fluxo de ar,
etc.);
8. Problemas com o instrumento também
podem causar flutuações na linha de base, caso em que normalmente ocorre
instabilidade de pressão. Por exemplo, o filtro de garrafa de fase móvel está
entupido, o elemento filtrante da válvula ativa de entrada está entupido, a
válvula unidirecional está bloqueada por contaminantes, o cabeçote da bomba tem
bolhas, vazamento de fase móvel pelo caminho fluídico (conectores / tubulações
danificadas) etc.
P9:
Quanto é a vida útil da coluna cromatográfica?
R:
A vida útil da coluna cromatográfica é de cerca de 1000 injeções, enquanto a
vida útil da coluna de guarda é de cerca de 280 injeções. É afetado
principalmente por condições cromatográficas e condições de armazenamento.
Sinais de coluna velha: aumento da pressão da coluna, diminuição da eficiência
da coluna, cauda do formato do pico, alargamento do formato do pico, mudança do
tempo de retenção, perda de fase estacionária, etc.
1. Existem duas condições
cromatográficas básicas:
- Numa mesma análise, a coluna
cromatográfica usada anteriormente tem uma vida útil maior. Neste caso, deve-se
verificar se as condições cromatográficas são consistentes. A composição da
amostra e os contaminantes fortemente absorvidos na amostra destruirão a
eficiência da coluna cromatográfica. Se for confirmado que as condições
cromatográficas não mudaram, pode-se especular que a causa seja o leito
cromatográfico da coluna danificado. Durante a rotina do laboratório e
transporte, a vibração violenta da coluna cromatográfica levará à danos no
leito cromatográfica da coluna;
- Todas as colunas cromatográficas
usadas nesta análise são danificadas após o mesmo número de vezes, e o motivo
mais provável é que os componentes da amostra estão adsorvidos na cabeça da
coluna cromatográfica. Podem ser precipitados insolúveis na fase móvel ou
substâncias com forte absorção;
- Manuseie as amostras usando técnicas
apropriadas de preparação de amostras. A extração em fase sólida (SPE) foi
realizada com uma coluna de extração em fase sólida semelhante à coluna
analítica;
- Use coluna de guarda. A coluna de
guarda é instalada na frente da coluna cromatográfica como coluna de sacrifício
e será substituída em caso de problemas. A tecnologia de empacotamento e
enchimento da coluna de guardao deve ser a mesma da coluna analítica;
2. O método de uso está incorreto e
geralmente é raro usar a coluna de acordo com as instruções do fabricante
- O pH da fase móvel está fora da
faixa de uso, resultando na ligação da coluna, hidrólise da fase ou dissolução
da matriz. Também ocorre quando a amostra é dissolvida com ácido ou álcali
forte;
- A alta temperatura também causará
danos à coluna cromatográfica. Por exemplo, a alta temperatura acelerará a
dissolução da fase ligada;
- Cuidados com colunas especiais, como
a coluna amino, podem reagir com aldeídos e cetonas. A coluna amino será
fortemente alcalina em solução aquosa sem tamponamento e dissolverá da sílica
estruturante;
- Colunas expostas ao solvente errado
também entrarão em colapso. Porque essas colunas são baseadas em uma estrutura
muito delicada. Elas são parcialmente ligadas pela adesão entre as partículas.
Se colocado em uma fase móvel que possa quebrar essa adesão, o leito da coluna
provavelmente colapsará. Esse problema às vezes ocorre quando a coluna de ciano
está em solução neutra e a coluna de fenil está em THF. Esta é outra razão para
não lavar a coluna.
P10:
Análise de causa de pico cromatográficos dividindo ou bifurcando
R:
1. Contaminação da coluna
Não há problema no início, mas após um
período de uso, esse problema pode ser causado pela contaminação. Neste
momento, é necessário reforçar a lavagem da coluna cromatográfica, ou seja,
utilizar um solvente mais forte do que a fase móvel utilizada no método para
lavar a coluna cromatográfica.
2. A coluna de guarda falha
Se a matriz da amostra estiver suja,
após um período de uso, problemas como bifurcação de pico ou cauda podem ser
causados pela falha da coluna de guarda. De um modo geral, se o número de
pratos teóricos, pressão ou resolução mudar em mais de 10%, a coluna de
proteção precisa ser substituída. A coluna de proteção é um consumível,
recomenda-se substituí-la diretamente sem regeneração.
3. A conexão está conectada
incorretamente
Se houver um problema com a forma do pico
de cada pico durante o uso da coluna cromatográfica, verifique primeiro se há
um problema de conexão. A tubulação pode ser muito longa ou muito curta, o que
pode causar vazamento ou divisão de pico. Se o pivot (ponta da tubulação que se
projeta pra fora da anilha) estiver muito comprida, ocorrerá vazamento. Se o
pivot estiver curto, um volume morto será criado, formando uma cavidade de
mistura, resultando em volume extra coluna e deterioração do formato de pico.
4. Efeito solvente
Em cromatografia líquida de fase
reversa, como se utiliza muitas vezes 100 % de solventes orgânico ou 100% de
solvente forte, quando ocorrem injeções de grande volume, o pico cromatográfico
eluirá da coluna prematuramente, resultando em distorção do pico. Para evitar
estes problemas, o ideal é manter a composição de fase móvel mais próxima
possível do diluente das amostras, evitando este tipo de distorção mesmo em
injeções de grandes volumes.
5. Sobrecarga de amostra
Quando o volume de injeção ultrapassa
a capacidade da coluna, o pico da amostra apresenta bifurcação ou cauda, e a
solução é reduzir o volume de injeção.
6. Colapso da coluna cromatográfica
A bifurcação do pico causada pelo
colapso da coluna é difícil de reparar. Se a coluna cromatográfica é sempre
utilizada com pH acima de 7 ou próxima do seu limite de tolerância de pH, a
vida útil da coluna cromatográfica tende a diminuir pois a base de sílica do
leito empacotado se dissolverá e colapsará prematuramente. Se a coluna entrar
em colapso, você verá que a forma de cada pico no cromatograma mudará (cauda de
pico, alargamento ou bifurcação) e poderá correr na direção oposta em pouco
tempo. Recomenda-se substituir a coluna diretamente. Preste atenção para
diminuir a temperatura abaixo de 40°C durante o uso diário, especialmente ao
usar fases móveis de pH alto.
7. O frit de coluna está parcialmente
bloqueado devido à análise frequente de amostras contaminadas.
Se não houver nenhuma coluna de guarda
ou filtro pré-coluna em linha, é provável que material particulado e adsorventes
fortes bloqueiem o frit na entrada da coluna e a pressão aumente ao mesmo
tempo. A solução é geralmente a retro lavagem da coluna.
8. O desempenho da coluna
cromatográfica é degradado
Colunas cromatográficas utilizadas
para analisar diferentes métodos costumam se deteriorar mais rápido se não
forem adequadamente limpas, pois trabalham com analitos muito diferentes,
matrizes mais complexas etc., e após determinado período de uso irão mudanças
sutis, que causarão bifurcação, cauda ou alteração no tempo de retenção.
FIM
