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Welch / Chromastore artigo 25FEV22
Traduzido por Ronaldo Buissa Netto
Perguntas e Respostas sobre
Cromatografia Líquida
Esta é a parte 4 da série de perguntas e respostas sobre Cromatografia
Líquida que foi publicada anteriormente. Esta parte abordará mais perguntas e
respostas, que o ajudarão a saber mais sobre cromatografia líquida.
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P: Como podemos evitar cauda no meu pico ?
R: Antes de tudo, precisamos descobrir a causa da
formação de cauda, que geralmente é causado pelos seguintes motivos: efeitos
extra coluna, leito empacotado contaminado e interação entre analito e sítio
ativo na fase ligada, e cada um dos motivos precisa ser tratado separadamente.
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P: Como identificar a causa da cauda no meu pico ?
R: O cromatograma pode fornecer muitas pistas para
identificarmos o problema. A natureza da amostra e as condições analíticas
também nos dão informações indispensáveis para isolar este tipo de problema. A
sobrecarga de massa é um dos possíveis problemas da formação de cauda; a
injeção da amostra diluída 1:10 indicará se o formato de pico poderá ser
melhorado somente com esta mudança de concentração. Se a cauda persistir mesmo
em baixas concentrações, observe o cromatograma. Se houver muitos picos no
cromatograma, veja se cada padrão de pico mantém um certo grau de cauda ou tem
uma tendência consistente ao longo do tempo. Se os picos que eluem mais cedo
apresentam mais cauda que os picos mais retidos, considere os efeitos extra
coluna (tubos muito compridos, diâmetros internos incorretos e conexões mal
formatadas são os principais problemas). Se todos os picos no cromatograma
tiverem o mesmo grau de cauda, existem duas possibilidades: 1) danos no leito
empacotado, 2) todas as amostras no cromatograma têm estrutura química
semelhante e a cauda é causada por um efeito químico.
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P: Quais substâncias produzem esses efeitos químicos,
você pode explicar? Como lidar com isso ?
R: Existem vários efeitos químicos, sendo o mais comum a
interação de analitos com sítios ativos no leito cromatográfico. A cauda de
compostos básicos na coluna de fase reversa é bem comum. Normalmente, compostos
com grupos polares ou básicos como – COOH, – NH2, – NHR, – NR2 podem ter
adsorção secundária entre hidroxilas e silanóis residuais na superfície do
leito empacotado, resultando em cauda.
Soluções:
1) Para a análise de compostos básicos, a trietilamina
(TEA) pode ser adicionada à fase móvel como agente redutor de cauda. O TEA
compete com o composto básico para ligar o grupo hidroxila ao silanol residual,
minimizando assim as interações entre o analito e a superfície do leito
cromatográfico.
2) A cauda de compostos ácidos requer a redução do
valor de pH da fase móvel para protonar o ácido o máximo possível. Ácidos
orgânicos competitivos podem ser adicionados à fase móvel, como o ácido
trifluoroacético (TFA) 0,1%, que tem um melhor resultado pois tem UV cut-off
baixo (comprimento de onda limite onde aquele aditivo começa a apresentar
leitura na região do UV).
3) Aumentar a concentração de sais tampão na fase móvel
para inibir a ação iônica.
4) Adicione reagente de pareamento iônico à fase móvel,
concentração 0,003-0,01 mol/L, para otimizar o formato de pico e aumentar a
retenção do composto.
5) Escolha colunas de sílica de alta pureza e capeadas,
como: Welch Ultisil® Polar-RP, Xtimate® C18, etc.
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P: Em alguns cromatogramas, podemos ver o pico
cromatográfico com cauda frontal. O que causa a cauda frontal em um pico ?
R: Em primeiro lugar, também precisamos encontrar as
razões para a cauda frontal de um pico. A cauda frontal de um pico geralmente
tem os seguintes motivos: volumes extra coluna, leito empacotado contaminado e
efeito do solvente. Isso exige que encontremos a causa e resolvamos o problema
observando o cromatograma. Claro que, no caso de sobrecarga de amostra, também
verificamos reduzindo a concentração da amostra. Se mesmo em baixas
concentrações ainda verificamos a cauda frontal, observe o cromatograma. Se
houver muitos picos no cromatograma, veja se cada tipo de pico mantém um certo
grau de cauda frontal ou se tem uma tendência de mudança consistente com o
tempo, ou seja, picos eluidos mais cedo apresentam mais ou menos cauda frontal
que picos eluidos tardiamente. Se a cauda frontal é mais intensa que a cauda
traseira do pico no cromatograma, devemos considerar tanto os efeitos extra
coluna como também efeitos de solvente. Se o formato da cauda frontal for
semelhante a todos os picos no cromatograma, isso pode ser causado por leito empacotado
danificado ou pelas propriedades químicas das substâncias da amostra a ser
separada.
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P: Como você resolve a cauda frontal em um pico?
R:
1) Para cauda frontal de pico causada pelo efeito do
solvente, em cromatografia de fase reversa, se for usado solvente 100% orgânico
ou 100% modificador de fase forte, o pico cromatográfico será lavado da coluna
cromatográfica prematuramente durante a injeção de grande volume, resultando em
deformação do pico, que pode ser evitada fazendo injeções de volumes menores
com a utilização de fase móvel como diluente, ou diluente com composição
química (polaridade) mais próxima da fase móvel. Se um modificador de fase
forte precisa ser utilizado como diluente, é necessário reduzir o volume de
injeção.
2) Se a cauda frontal é causada por efeitos extra
coluna, precisamos reduzir o volume morto do sistema cromatográfico e, em
seguida, resolver o fenômeno da cauda frontal.
3) Para cauda frontal causada pela natureza da amostra,
pode-se considerar aumentar a concentração de sal tampão na fase móvel,
aumentar a força iônica na fase móvel, ou adicionar uma quantidade adequada de
tetrahidrofurano (THF) na fase móvel (geralmente 5%). Aumentar a temperatura da
coluna também é uma boa alternativa.
4) Volume morto na cabeça da coluna - o espaço gerado
pelo dano causado ao empacotamento cromatográfico na cabeça da coluna faz com
que a vazão da fase móvel e do soluto se movam mais rápido do que a vazão
média, resultando em cauda ou extensão de pico.
5) Coeluição – duas substâncias quimicamente parecidas
não estão separadas, mas aparenta ser uma cauda frontal.
Análise de
caso de cauda frontal de pico: coluna C18, a fase móvel água-metanol (55:45), a
substância de referência e os picos de amostra são todos encaminhados?
1) Sobrecarga de amostra. Reduza a concentração de
injeção para ver se a forma do pico é melhorada. Geralmente considera-se que a
altura do pico é de cerca de 100 mAU, o que não afetará a forma do pico devido
à sobrecarga.
2) Verifique se a amostra está dissolvida em fase
móvel. A capacidade de eluição do solvente (como metanol puro) dissolvendo a
amostra é mais forte do que a da fase móvel, e o pico será atrasado. Quando uma
amostra é diluída pela fase móvel, ela apresenta deslocamento uniforme durante
todo o seu percurso de interações com o leito cromatográfico empacotado, pois
fase móvel e amostra apresenta química semelhante. O uso de modificador de fase
forte como diluente altera a maneira que a amostra avança na coluna, alterando
a velocidade de eluição, causando interações não esperadas e efeitos no formato
de pico.
3) Aumente a concentração de sal tampão na fase móvel.
Aumentar a concentração de sal tampão pode aumentar a força iônica na fase
móvel e reduzir o atraso no deslocamento causado pela ação eletrostática (que
pode existir entre as moléculas da amostra ou entre as moléculas da amostra e a
superfície do empacotamento).
4) Adicione uma quantidade apropriada de
tetrahidrofurano na fase móvel. A adição de uma pequena quantidade de
tetrahidrofurano à fase móvel pode algumas vezes melhorar a forma do pico e
aumentar a resolução. Muitos cromatografistas conhecem o recurso e o utilizam,
mas seu mecanismo parece raramente ser mencionado. Normalmente, a quantidade
adicionada é inferior a 5%, e uma quantidade maior pode ser adicionada quando
necessário.
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P: Como a coluna HPLC deve ser ativada ?
R: Verifique sempre o
manual de cuidados de sua coluna antes de seguir qualquer procedimento. Para colunas de cromatografia líquida, cada coluna é
testada antes do envio e armazenada no eluente de teste para transporte.
Portanto, no primeiro uso, recomenda-se ativar com uma fase móvel 80:20
(MeOH:H2O), com fluxo moderado (normalmente metade do fluxo do método a ser
utilizado), por aproximadamente 4 horas; em seguida a coluna cromatográfica
pode ser completamente equilibrada com a fase móvel. Se forem usados aditivos
de fase móvel (como tampão ou reagente de pareamento iônico), recomenda-se usar
a fase móvel com a proporção original, mas sem esses aditivos para transição
intermediária, e então substituí-la pela fase móvel da amostra analítica após
10 – 20 volumes de coluna. Para colunas com fases ligadas de cadeia química
curta (por exemplo, C8, fenil, CN), deve-se tomar cuidado para garantir que
elas estejam completamente equilibradas antes de usar a coluna. Isso garante a
repetibilidade e ajuda a evitar desvios no tempo de retenção.
O solvente de fase normal e o
solvente de fase reversa são imiscíveis, o que não pode ser ignorado. Para uma
coluna recém-adquirida, abra primeiro o manual de cuidados da coluna e seu
certificado de análise e teste para verificar o solvente de armazenamento da
coluna. Se o solvente de armazenamento for imiscível com a fase móvel que você
usará, faça a transição com isopropanol primeiro. Durante o processo de
transição, preste atenção ao aumento da pressão da coluna devido à alta viscosidade
do isopropanol e reduza adequadamente o fluxo. Se a fase móvel contém sais
tampão, primeiro use a fase móvel com a mesma proporção sem sais tampão para
evitar a precipitação de sais tampão.
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P: Quando uso a coluna amino para analisar açúcares, por
que o tempo de retenção do analito de interesse é instável e avança
gradualmente ?
R: Isso é causado pelas características da coluna amino.
Ao analisar açúcares, a fase móvel típica da coluna amino é de 60% ~ 90% de
mistura de água:acetonitrila. Durante o uso, a alta concentração de grupos
amino (pH básico) nas lacunas do leito empacotado resultam na hidrólise lenta
da sílica e da fase ligada. Com o passar do tempo, o leito se torna mais
ineficiente, o que levará à mudança do tempo de retenção do analito de
interesse. Ao mesmo tempo, isso explica o porquê a vida útil de uma coluna
Amino diminui em condições de fase reversa.
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P: Alta pressão de coluna ?
R: O aumento de pressão da coluna cromatográfica é um
problema comum na rotina dos analistas de cromatografia líquida, e um
entupimento é um dos primeiros suspeitos. As principais razões para o aumento
da pressão são resumidas da seguinte forma:
- O frit na entrada da coluna cromatográfica está
parcialmente entupido;
- A amostra ou sal tampão da fase móvel precipita na
coluna cromatográfica;
- Contaminação da coluna cromatográfica;
- A viscosidade da fase móvel é muito alta;
- O filtro em linha ou a coluna de guarda está
entupida;
- Entupimento de tubulação;
- Coluna polimérica: inchaço causado pela mudança de
solvente.
Soluções:
1- Lave a coluna cromatográfica por retrolavagem
(backflush) com um ~ 1/4 do fluxo de trabalho sem conectar o detector para
remover o entupimento do frit (exceto para coluna cromatográfica de partículas
de 1,8μm – colunas UHPLC).
2- Tente usar a fase móvel como solvente da amostra
para reduzir a possibilidade de precipitação da amostra. Reduza ao máximo a
concentração de sal na fase móvel. Após o uso da fase móvel com sal, a coluna
deve ser lavada com 10 a 20 volumes de coluna de água ultrapura e fase orgânica
na mesma proporção do sal na fase móvel, e então armazenada em solvente
adequado.
3- A coluna cromatográfica está contaminada e precisa
ser limpa e regenerada.
4- Tente escolher um solvente de baixa viscosidade como
fase móvel ou aumente a temperatura da coluna.
5- Verifique o frit do filtro em linha e o cartucho da
coluna de guarda e substitua-os necessário.
6- Desmonte a tubulação para verificação se a pressão
cai e substitua se necessário.
7- Para colunas à base de polímeros, são necessárias
informações sobre a compatibilidade do solvente.
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P: Pressão baixa na coluna ?
R: Quando a pressão da coluna cromatográfica diminui, um
“vazamento” deve ser considerado primeiro. As principais razões para o
aparecimento de baixa pressão são resumidas a seguir:
1- O elemento filtrante de entrada de solvente está
bloqueado (filtro de garrafa do solvente);
2- Vazamento no sistema pressurizado (parafusos,
anilhas, tubulações, selos de bomba, válvulas de injeção, assentos de agulham
entre outros componentes);
3- Mudança de solvente ou fluxo;
4- A válvula de entrada da bomba falha (check valve de
entrada);
5- A válvula de saída da bomba falha (check valve de
saída);
6- Leito empacotado da coluna cromatográfica danificado
e perda de fase estacionária.
Solução:
1- Verifique todas as tubulações, conectores e
componentes do sistema fluídico pressurizado;
2- Substitua a coluna cromatográfica;
3- Verifique se as condições cromatográficas mudaram;
4- Verifique se o fluxo da bomba é preciso.
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P: O que é volume morto e volume de atraso da fase
líquida ?
R:
1) Volume
morto
Refere-se ao volume entre o
ponto de injeção efetivo ao ponto de detecção efetivo que exclui a porção da
coluna que contém a fase estacionária. Consiste em 4 partes: o volume do tubo
do injetor à coluna cromatográfica, o espaço entre as partículas da fase estacionária
na coluna (ocupada pela fase móvel, Vm), o volume do tubo de saída da coluna e
o volume da célula de fluxo do detector. Entre eles, apenas Vm participa do
processo de equilíbrio cromatográfico, e as outras três partes apenas
desempenham um papel no alargamento do pico. Para minimizar este problema de
alargamento do pico, o volume dessas três partes deve ser minimizado ao máximo.
2) Volume de
atraso
O volume de atraso refere-se ao
volume entre o ponto de mistura do solvente (geralmente na câmara de mistura /
mixer ou válvula proporcionadora de gradiente / GPV / MCGV de um cromatógrafo
líquido) e a cabeça da coluna cromatográfica.
