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Welch / Chromastore artigo 11FEV22
Traduzido por Ronaldo Buissa Netto
Perguntas e Respostas sobre
Cromatografia Líquida
Esta é a parte 3 da série de perguntas e respostas sobre Cromatografia
Líquida que foi publicada anteriormente. Esta parte abordará mais perguntas e
respostas, que o ajudarão a saber mais sobre cromatografia líquida.
1
P: Qual solvente é
adequado para armazenar colunas de sílica gel utilizadas em cromatografia de
fase normal ?
R: Não importa se o
período de armazenamento é curto ou longo, indicamos o uso de uma fase móvel geralmente
composta por n-hexano e uma pequena quantidade de isopropanol (95:5 / 99:1 / 99,5:0,5).
2
P: Por que os
tamponamentos com fosfatos diminuem a vida útil da coluna cromatográfica ?
Comparado com outros tampões, quanto o uso do tampão fosfato reduz a vida útil
da coluna ?
R: Em primeiro lugar,
precisamos corrigir um mal-entendido. Para colunas cromatográficas, um pH > 6,5
não é um “ambiente neutro” como todos entendem. Quando o pH do sal tampão é
superior a 6,5, é um ambiente alcalino para a coluna cromatográfica, por isso é
prejudicial à matriz de sílica. Além disso, a molécula de fosfato é pequena, o
que facilita sua entrada na fase ligada, resultando na hidrólise destas
ligações entre base estruturante de sílica e a fase ligada. Devido às vantagens
insubstituíveis do tampão de fosfato, como propriedade estáveis, excelente capacidade
de tamponamento, entre outras, este é um dos sais mais utilizados no
cromatografia líquida, o que obriga os usuários a aceitarem que uma coluna
cromatográfica terá sua vida útil diminuída devido ao uso rotineiro deste sal.
3
P: Como os reagentes
de pareamento iônico funcionam na cromatografia de fase reversa por pareamento
iônico ?
R: Em primeiro lugar,
a extremidade polar do reagente de pareamento iônico se associa ao íon alvo formando
um complexo para reduzir sua polaridade, para que possa ser melhor retido na
coluna cromatográfica. Além disso, de acordo com a teoria do efeito
hidrofóbico, a extremidade hidrofóbica do reagente de pareamento iônico
interage facilmente com a cadeia C18 (ou outro grupo apolar presente na superfície
da sílica), por isso é mais fácil conseguir retenção na coluna. Portanto, a
ação do reagente de pareamento iônico é um mecanismo de retenção misto, ou
seja, a atuação do pareador iônico na formação do complexo entre analito e
pareador e a sua atuação “mascarando” os grupos polares presentes no analito.
Essas duas ações ocorrem juntas.
4
P: Qual é a diferença entre
o reagente do pareamento iônico tetrabutilamônio e o alquil sulfonato de sódio ?
Por que o tetrabutilamônio tem uma influência tão grande na vida útil da coluna
cromatográfica ?
R: O tetrabutilamônio como pareador iônico
não é tão utilizados quanto os reagentes de pareamento iônico de alquil
sulfonato de sódio. A razão é que as substâncias polares ácidas podem
facilmente melhorar a capacidade de retenção na cromatografia de fase reversa,
reduzindo o valor do pH. A redução do pH pode inibir a ionização do ácido,
tornar o ácido em estado neutro e aumentar a interação com a cadeia de carbono
hidrofóbica. Os analitos alcalinos são seriamente afetados pelo limite superior
do pH da matriz de sílica, e é difícil ajustar o pH da fase móvel para muito
alto. Portanto, reagentes de pareamento de cátions são frequentemente
adicionados em pH baixo ao analisar compostos alcalinos. Experimentos mostram
que os reagentes de pareamento iônico tetrabutilamônio são mais difíceis de remover
da superfície de empacotamento da coluna do que o pareador alquil sulfonato de
sódio e outros reagentes de pareamento de cátions, por isso a desgaste intenso
e prematuro da vida útil da coluna cromatográfica.
5
P: Por que o tempo de
retenção muda para a mesma coluna cromatográfica, depois de terminar o Projeto
A e depois o Projeto B ? Por que a forma do pico é anormal ? O que vai
acontecer ?
R: A coluna
cromatográfica está contaminada por substâncias de forte retenção, ou seja,
após a interação do contaminante com o leito empacotado, o tempo de retenção é
adiantado ou atrasado. A identificação do problema depende da natureza do contaminante
e da ação conjunta do analito, fase estacionária e contaminante na superfície
da coluna, e quanto mais complexa essa interação, mais difícil prever os
resultados experimentais futuros. Durante a manutenção de rotina, preste
atenção à retrolavagem e a limpeza dos contaminantes com solvente que possa
dissolvê-los após a sua análise, de modo a reduzir ou evitar esta situação.
6
P: Qual é o objetivo
da derivatização pré-coluna por HPLC?
R: O método de
derivatização química na tecnologia cromatográfica refere-se ao método de
separação e detecção após a mudança dos componentes da amostra em derivados
correspondentes com reagentes químicos especiais (geralmente referidos como
reagentes de derivatização) no processo cromatográfico. O objetivo é: 1.
Melhorar a sensibilidade de detecção através da introdução de grupos funcionais
de forte absorção no ultravioleta-visível no analito a ser detectado ou
adicionando grupos fluorescentes para convertê-los em derivados fluorescentes;
2. Melhorar a separação e seletividade de amostras analíticas.
7
P: Quando tenho vários
analitos difíceis de separar, como melhorar a separação selecionando a coluna
apropriada ?
R: Três fatores
principais influênciam na separação: eficiência da coluna, seletividade e fator
de retenção. A eficiência da coluna pode ser melhorada reduzindo o tamanho de
partícula do leito empacotado e aumentando o comprimento da coluna; a
seletividade está relacionada com a seleção da fase estacionária e condições de
pH. A seletividade pode ser melhorada selecionando a coluna cromatográfica
apropriada e pH apropriado; O fator de retenção está relacionado principalmente
à composição e proporção da fase móvel; além disso o pH e a força iônica da
fase móvel afetam o estado existente do analito de interesse e também afetam o
fator de retenção. Às vezes, aumentar o fator de retenção também pode melhorar
a separação.
8
P: Quando devo
considerar o uso de colunas Fenil e colunas Ciano?
R: As colunas Fenil
tem alta seletividade para a determinação de compostos aromáticos contendo anel
benzênico. As colunas CN pode ser usadas como uma coluna de fase reversa com a
capacidade de retenção mais fraca ou uma coluna de fase normal com atividade
reduzida.
9
P: Tenho o mesmo tipo
de coluna em diferentes comprimentos e tamanhos de partículas. Como escolher
entre elas ?
R: O comprimento e o
tamanho da partícula são usados para alterar a eficiência da coluna (quanto
mais comprida a coluna, mais eficiente; quanto menos o tamanho de partícula,
mais eficiente). Quando o número de substâncias a serem separadas é ≤ 5, a
coluna cromatográfica com comprimento de coluna de 150 mm pode atender a
separação da maioria das amostras.
10
P: Uma coluna C18
comum pode ser usada como coluna cromatográfica de fase normal ? Que tipo de
coluna cromatográfica é a mais comum e a mais usada na cromatografia de fase
normal? O que deve ser observado no uso da coluna de fase normal em comparação
com a coluna de fase reversa?
R: O modo de separação
da cromatografia de fase normal significa que a polaridade da fase estacionária
é maior que a da fase móvel. Na cromatografia de fase reversa, a polaridade da
fase móvel é maior que da fase estacionária. A fase estacionária C18 é
relativamente hidrofóbica. Hidrofobicidade forte significa que a polaridade é
muito fraca. Não deve haver fase móvel com polaridade mais fraca do que ela.
Além disso, ao usar a coluna cromatográfica, deve-se notar que a fase
estacionária polar deve evitar o solvente polar tanto quanto possível, e a fase
estacionária não polar deve evitar o solvente não polar o máximo possível, caso
contrário, o efeito da “miscibilidade semelhante” pode ocorrer (eluição
demorada / longos tempos de retenção).
As colunas de fase normal mais comuns incluem as colunas de sílica, coluna amino, coluna CN e coluna à base Diol. A coluna mais comum deve ser a coluna de sílica gel. A coisa mais importante a se prestar atenção quando utilizando uma coluna de fase normal é com relação a água. A coluna de fase normal é muito sensível à umidade / água. A pequena alteração do teor de umidade / água na fase móvel tem grande influência no tempo de retenção. Portanto, o tempo de equilíbrio de uma coluna de fase normal pode variar de algumas horas ou até mais.
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