Guia para escolha de vials

 

Você já parou para pensar o quão importante é a escolha correta dos seus vials para os amostradores automáticos dos seus instrumentos analíticos ?

Sabemos que o custo de um vial é insignificante perto dos valores gastos com instrumentação analítica, manutenção, contrato de serviços, etc, mas isso não quer dizer que não temos com o que se preocupar quando falamos deste consumível tão importante para a rotina do seu laboratório.

O conjunto de consumíveis utilizados para conter sua amostra dentro do amostrador automático é composto por vial, tampa, septo e em alguns casos, insert.

O que devemos considerar quando escolhemos o vial para seu amostrador automático ?

Compatibilidade com o amostrador: nem todos os amostradores são iguais. Alguns trabalham com braços robóticos para pegar o seu vial; outros utilizam de carrosel ou bandejas que se movem até a agulha de injeção; em outros modelos, a agulha vai até o sua amostra; alguns amostradores possuem um pegador magnético para mover seu vial até a agulha de injeção. As dimensões dos vials também podem variar de acordo com o fabricante do amostrador. A maioria deles trabalha com vials 12 x 32 mm. Sempre consulte o manual do usuário de seu amostrador para escolher as dimensões de seu vial.

Volume de amostra: a quantidade de amostra disponível é fator primordial na escolha correta do seu vial. Se você tem uma quantidade limitada de amostra disponível, você deverá escolher entre usar um insert dentro do seu vial, usar um micro vial ou até um vial de alta recuperação.

Compatibilidade dos componentes do vial com a amostra: a compatibilidade entre analito e solventes deve ser considerado quando estamos escolhendo o vial e seus acessórios. Por exemplo, se sua amostra é sensível à luz, um vial âmbar deve ser utilizado; um vial de plástico é indicado quando sua amostra interage com o vidro, para cromatografia de íons, AA, ICP MS ou eletroforese capilar. A composição do vidro é outro importante ponto quando falamos de inerticidade química: a USP classifica as vidrarias de laboratório de acordo com sua resistência ao ataque de água. Coeficiente linear de expansão é outro parâmetro a se considerar: quanto menos seu coeficiente, melhor o vidro pode suportar as mudanças de temperatura sem se fraturar. Vials silanizados ou desativados passam por um tratamento químico que tornam sua superfície mais hidrofóbica e inerte, sendo indicados para amostras mais sensíveis como semivoláteis e pesticidas.

Tampas: as tampas podem ser encontradas com rosca, lacrável (crimp) e encaixadas (snap). Tampas rosqueáveis oferecem baixa evaporação, reutilização e menores riscos de ferir as mãos no uso do lacrador / deslacrador. Tampas lacráveis oferecem a melhor vedação mas são descartáveis. Já as tampas encaixadas oferecem praticidade por serem rápidas pra abrir e fechar os vials, mas só são indicadas para amostras não voláteis pois sua vedação não é tão eficiente como as tampas rosqueáveis e lacráveis.

Septos: os septos são fabricados de diferentes materiais e possuem mais de uma camada. É importante verificar a compatibilidade do seu septo com a amostra e os solventes utilizados. Existe a opção de dos septos pré cortados, que mantém o equilíbrio de pressão interna e externa, além de facilitar a penetração pela agulha do amostrador; indicados para amostras não voláteis e para injeções de grande volume proporcionalmente ao volume do vial (1 injeção de 800 uL num vial de 2 mL).

Inserts: é um acessório muito utilizado quando a quantidade de amostra é um fator limitante para o cliente. O formato e o volume são importantes parâmentros no escolha correta do seu insert. Os inserts de fundo chato possuem maior volume, mas em contrapartida apresentam o maior volume residual. Já os inserts cônicos possuem volumes menores, mas seu formato proporciona um aproveitamento máximo do volume de amostra.

Outros acessórios

Lacrador / Deslacrador manual ou eletrônico: ferramenta obrigatória para selar seus vials utilizando tampas lacráveis. Cuidado com aperto excessivo, que podem causar a quebra do vial e o tensionamento do septo, que pode entortar a agulha do seu amostrador automático.

Vials com insert integrado: podem ser fabricados em vidro ou plástico, são uma solução prática para usuários com volume limitado de amostra, pois não é necessário inserir o insert dentro de cada um dos vials a ser utilizado durante a análise.

Vials de alta recuperação (volume residual mínimo): este tipo de vial apresenta o fundo cônico, facilitando a retirada de pequenos volumes. Indicado aos usuários com volume de amostra limitada.

Problemas causados pela escolha errada de vials e acessórios:

- picos fantasmas devido a interações do analito e / ou solvente com vial e / ou septo;

- interferência com os analitos de sua amostra, causado pela interação de seus analitos com o vidro borosilicato de baixa qualidade, com o vial plástico ou com as camadas do septo;

- perda de analitos ou concentração de analitos devido à evaporação de solventes ou do próprio analito de interesse, causado pela má vedação do conjunto vial + tampa + septo;

- danos físicos ao seu amostrador, causados por vials / inserts com dimensões erradas ou com deformação na sua construção (paredes finas demais podem causar a quebra, ou fundo irregular são alguns exemplos), septos muito tensionados (risco de entortar a agulha do seu amostrador automático);

- degradação de sua amostra, devido à má vedação ou interações com vial / insert / septo de má qualidade;

- baixa reprodutibilidade de suas injeções, causado pela evaporação de amostra e / ou solventes.

Dicas práticas:

- quando comprando vials, não mantenha sua atenção no volume máximo, que pode variar de 1,5 mL à 2 mL dependendo de onde o fabricante mede este limite; se atente às dimensões do vial (altura, diâmetro e largura do pescoço);

- ND ou N: muitos fabricantes ou revendedores trazem esta informação na descrição do vial (ND9, N8, etc). Isso significa que o diâmetro do pescoço é 9 mm, 8 mm, etc. Esta é sim uma informação crucial no momento da compra. Vials ND8 ou N8 são conhecidos como vials de boca estreita; vials ND9 ou N9 como vials de boca larga; vials ND11 ou N11 são os vials compatíveis com tampas lacráveis ou encaixadas;

- opte pelos vials de rosca curta (425), pois vedam muito bem mas diminuem o tempo de rosqueamento em até 30%;

- lembre se que quando você utiliza um insert ou um vial com insert integrado, você está mudando a altura do fundo do seu vial, e dependendo do tipo de amostrador que você está utilizando, a agulha deste pode encostar no fundo do vial ou insert, causando irreprodutibilidade entre as injeções e nos piores dos casos até entortar a agulha ou mesmo a quebra do vial no momento da injeção ; vá no software de controle do seu injetor automático e ajuste a altura de coleta da agulha.

HPLC na prática - parte 5: Colunas dedicadas

 

Não há nada mais frustrante para um cromatografista do que chegar no dia seguinte em frente do seu HPLC e perceber que aquela sêquencia colocada pra rodar no dia anterior foi perdida.

Não importa se era um teste, 5 lotes de produto final, estabilidade ou uma validação de método, aquele instante da descoberta é frustrante e a única coisa que queremos saber é o que causou o problema.

Em geral procuramos por erros grandes para justificar o problema: uma coluna saturada, uma fase móvel preparada errada ou um defeito no equipamento.

Mas na maioria das vezes não encontramos o tal “problema”, e dependendo do nível de compliance da empresa em que você atua, alguns dias serão perdidos tentando justificar o erro, sem encontrar o real motivo para o problema.

O que muitos usuários de cromatografia líquida ainda não perceberam é que em geral, este “problema” grande que estamos procurando nada mais é do que a somatória de pequenos erros gerados na nossa rotina de preparação do sistema HPLC para aquela análise.

Nos próximos posts iremos tratar em detalhes quais são os cuidados que os cromatografistas experientes

utilizam em sua rotina para garantir uma rotina produtiva e confiável.

Colunas dedicadas: para alguns segmentos do mercado, falar em coluna dedicada é redundância, mas esta não é a realidade de todo o mercado de cromatografia.

Laboratórios de prestação de serviços não fazem sempre a mesma análise, mas sim o que o cliente precisa e quase sempre não é uma única metodologia.

Empresas de médio e pequeno porte não possuem grandes orçamentos para manter 20 ou 30 colunas para cada um dos seus produtos, por isso compartilham as colunas entre métodos.

Mas por que ter colunas dedicadas irá melhorar a eficiência da minha rotina cromatográfica ?:

    - a durabilidade de uma coluna dedicada normalmente já é     conhecida, pois temos o histórico daquela análise, e por esta     razão já sabemos que uma dada coluna dura 500, 1000 ou 3000  injeções, e isso utilizado junto com o livro de registro analítico é  ferramenta importante para sabermos quando uma coluna vai   falhar numa adequabilidade de sistema e nos precavermos   trocando a coluna antecipadamente;

    - o número de interferentes e o tipo deles também já é conhecido numa coluna dedicada, o que não causa surpresas entre rotinas diferentes, ou seja, um contaminante do método A pode coeluir com um analito do método B rodado na mesma coluna, causando perda de tempo e de produtividade;

    - as colunas dedicadas duram mais facilitam o cálculo do custo analítico, pois tenho um melhor controle da vida útil da coluna. Por exemplo: um método A tem uma coluna com vida útil média de 3000 injeções, já a coluna do método B dura por volta de 500 injeções; se cada análise minha consome 50 injeções (método A e B - hipotético para efeito de cálculo),  numa coluna dedicada eu teria uma coluna durando 60 análises pro método A e pro método B a coluna dedicada duraria 10 análises. Como eu teria certeza do custo analítico numa coluna compartilhada ?

- em colunas dedicadas o tempo gasto com equilíbrio e limpeza é menor ou pelo menos mais eficiente: se seu método foi bem desenvolvido, parte desse desenvolvimento focou na limpeza da coluna, baseado nos tipos de modificadores utilizados, nos diferentes interferentes presentes naquela matriz, entre outros pontos importantes. Com isso, a limpeza após o uso da coluna é sempre o mesmo, dando maior previsibilidade com relação ao tempo gasto com aquela análise, cálculos como hora / máquina, hora / homem, hora / análise, etc.

Dicas práticas:

    - coluna é um consumível, vai gastar e acabar, por                            isso utilize ferramentas pra prever este fim e evitar perda         de tempo e produtividade;

- o custo de uma coluna para uma análise é relativamente baixo, quando comparado ao custo com outros consumíveis, como por exemplo SPE; não perca tempo tentando rodar uma análise com uma coluna com pratos teóricos comprometidos, troque por uma nova e previamente equilibrada e em paralelo tente limpar e / ou regenerar a coluna velha;

- mantenha registros de sua coluna: muitos usuários possuem logbook de equipamentos, mas não possuem logbook de colunas. Um registro básico com inormações como pressão, pratos teóricos, resolução e outros parâmetros cromatográficos nos ajudam a ter uma idéia bastante precisa das condições de nossa coluna;

- sempre mantenha o cromatograma das primeiras injeções como referência: uma simples comparação entre os formatos de pico da coluna nova e seu estado atual já eliminam a perda de tempo com tentativas de rodar adequabilidade de sistemas, injeções teste, etc.

HPLC na prática - parte 4: Degaseificação

 

Não há nada mais frustrante para um cromatografista do que chegar no dia seguinte em frente do seu HPLC e perceber que aquela sêquencia colocada pra rodar no dia anterior foi perdida.

Não importa se era um teste, 5 lotes de produto final, estabilidade ou uma validação de método, aquele instante da descoberta é frustrante e a única coisa que queremos saber é o que causou o problema.

Em geral procuramos por erros grandes para justificar o problema: uma coluna saturada, uma fase móvel preparada errada ou um defeito no equipamento.

Mas na maioria das vezes não encontramos o tal “problema”, e dependendo do nível de compliance da empresa em que você atua, alguns dias serão perdidos tentando justificar o erro, sem encontrar o real motivo para o problema.

O que muitos usuários de cromatografia líquida ainda não perceberam é que em geral, este “problema” grande que estamos procurando nada mais é do que a somatória de pequenos erros gerados na nossa rotina de preparação do sistema HPLC para aquela análise.

Nos próximos p

osts iremos tratar em detalhes quais são os cuidados que os cromatografistas experientes

utilizam em sua rotina para garantir uma rotina produtiva e confiável.

Degaseificação: a degaseificação é com certeza um dos pontos mais sensíveis quando tratamos de se manter uma rotina analítica eficiente e produtiva. Muitos ignoram a importância deste fator nos dias atuais, graças a grande eficiência dos degaseificadores em linha que existem hoje nos sistemas HPLC / UHPLC, mas isso não elimina o risco de problemas com bolhas.

Como funciona um degaseificador em linha: basicamente no caminho fluídico do seu HPLC há um pequeno tubo plástico permeável à gás dentro de uma pequena câmara onde é aplicado vácuo; como este tubo é bastante fino, ele apresenta uma boa área de contato e por diferença de pressão, o gás dissolvido ou pequenas bolhas são forçadas a permearem o tubo e saírem da sua fase móvel.

O que acontece quando uma bolha de ar passa pra dentro do sistema HPLC: há muitas possibilidades quando tentamos imaginar como a bolha se comporta dentro do sistema HLPLC. Bolhas grandes podem causar grande oscilação da pressão, o que em alguns sistema mais modernos causará o interropimento do fluxo; se você tiver sorte, ela pode apenas causar uma oscilação no fluxo e pressão, oque inevitavelmente causará algum efeito na cromatografia. Se esta bolha passar no sistema no momento da injeção, ela pode ocupar um determinado volume dentro do loop de amostragem, o que causará problemas de reprodutibilidade. Enquanto passa pela coluna, a bolha tende a ficar em solução, mas não elimina a possibilidade de alguma interação com a separação cromatográfica.

Mas ao sair da coluna, a pressão do sistema volta a ficar próxima a pressão ambiente e a bolha reaparece, podendo causar picos ou distúrbios de linha de base. Micro bolhas irão se apresentar como um ruído constante de linha de base, facilmente observável para quem já conhece a cromatografia daquele método / análise específica.

O oxigênio dissolvido na solução é mais grave para alguns tipos de detecção, como na fluorescência (supressão ou atenuação de alguns compostos), detectores de índice de refração ou para os detectores eletroquímicos em modo redutor.

Dicas práticas:

-    faça a degaseificação dos seus solventes para HPLC com vácuo e          ultrassom (método mais efetivo) por 10 min;

-    no caso de alta sensibilidade à presença de ar ou oxigênio dissolvido, utilize câmaras de degasser em série para aumentar a eficiência ou na purga com gás Hélio;

-    alterne o solvente utilizado nos canais do HPLC, para que ocorra um desgaste proporcional em todos

      os canais;

-    monitore a pressão do seu sistema durante os primeiros minutos de equilíbrio ou corrida, para se

      observar a presença de bolhas ou micro bolhas.

HPLC na prática - parte 3: a importância do cleanup de amostra

 

Não há nada mais frustrante para um cromatografista do que chegar no dia seguinte em frente do seu HPLC e perceber que aquela sêquencia colocada pra rodar no dia anterior foi perdida.

Não importa se era um teste, 5 lotes de produto final, estabilidade ou uma validação de método, aquele instante da descoberta é frustrante e a única coisa que queremos saber é o que causou o problema.

Em geral procuramos por erros grandes para justificar o problema: uma coluna saturada, uma fase móvel preparada errada ou um defeito no equipamento.

Mas na maioria das vezes não encontramos o tal “problema”, e dependendo do nível de compliance da empresa em que você atua, alguns dias serão perdidos tentando justificar o erro, sem encontrar o real motivo para o problema.

O que muitos usuários de cromatografia líquida ainda não perceberam é que em geral, este “problema” grande que estamos procurando nada mais é do que a somatória de pequenos erros gerados na nossa rotina de preparação do sistema HPLC para aquela análise.

Nos próximos posts iremos tratar em detalhes quais são os cuidados que os cromatografistas experientes utilizam em sua rotina para garantir uma rotina produtiva e confiável.

A importância do cleanup de amostra: John Dolan, um dos maiores especialistas em cromatografia líquida do mundo conta que quando perguntam pra ele como fazer uma coluna durar para sempre a resposta que ele dá é simples: “nunca faça uma injeção”.

É muito importante entender que o processo de cleanup de amostra é determinado no desenvolvimento do método. Para que essa etapa seja bem desenvolvida, o conhecimento da matriz da amostra é indispensável, e nem sempre isso é feito com maestria. Quanto mais limpa é sua amostra, maior será a vida útil de sua coluna e mais confiável seu método será.

Um problema conhecido de tratamento de amostra é o uso de filtro de seringa. Muito utilizado para retirar material particulado da amostra, o filtro é utilizado de maneira errônea, pois não se leva em consideração o tipo de membrana (Nylon, PTFE, PVDF, PES, CF, etc), volume de filtração, tamanho de poro, perda de volume de amostra, por exemplo. Na indústria farmacêutica, por exemplo, filtro de seringa é quase uma regra, mas qual o peso da cada filtro no custo final da injeção ? Será que não adicionei algum contaminante na análise por utilizer o filtro errado ? Será que está ocorrendo alguma retenção seletiva de um compost específico ? Será que o processo de filtração não deva ser validado para garantir e eficiência e a robustez desse método ?

Outras maneiras de tratamento de amostra devem ser considerados, como o uso de cartuchos de extração em fase sólida SPE (“limpeza química”)  e a centrifugação.

O maior problema com este material particulado entrando no sistema é o entupimento do frit de coluna. Isso leva ao rápido e prematuro aumento de pressão e perda de eficiência da coluna, gerando perdas de tempo enormes, além do aumento do custo da operação com trocas prematuras de colunas.

Outro risco é de entupimento do sistema de injeção do seu HPLC. Os principais componentes que podem entupir são a agulha, o assento de agulha e os canais da válvula de injeção.

Considere o uso de filtros de linha no sistema de injeção (normalmente com 0.5 um de malha). Este filtro irá reter o material particulado que ficaria retido na frit de 2 um da coluna e pode ser trocado muito mais facilmente que o frit da coluna.

Resumindo:

• conheça bem sua matriz para a determinação do cleanup eficiente e com o melhor custo/benefício;
• ao determinar a filtração com filtro de seringa, conheça as possibilidades e valide para um método robusto;
• pense na utilização de filtro de linha no sistema de injeção, para minimizar problemas com entupimentos de frit de colunas ou de amostradores de injeção.

HPLC na prática: Dicas para uma rotina eficiente na cromatografia líquida – parte 2

Não há nada mais frustrante para um cromatografista do que chegar no dia seguinte em frente do seu HPLC e perceber que aquela sêquencia colocada pra rodar no dia anterior foi perdida.

Não importa se era um teste, 5 lotes de produto final, estabilidade ou uma validação de método, aquele instante da descoberta é frustrante e a única coisa que queremos saber é o que causou o problema.

Em geral procuramos por erros grandes para justificar o problema: uma coluna saturada, uma fase móvel preparada errada ou um defeito no equipamento.

Mas na maioria das vezes não encontramos o tal “problema”, e dependendo do nível de compliance da empresa em que você atua, alguns dias serão perdidos tentando justificar o erro, sem encontrar o real motivo para o problema.

O que muitos usuários de cromatografia líquida ainda não perceberam é que em geral, este “problema” grande que estamos procurando nada mais é do que a somatória de pequenos erros gerados na nossa rotina de preparação do sistema HPLC para aquela análise.

Nos próximos posts iremos tratar em detalhes quais são os cuidados que os cromatografistas experientes utilizam em sua rotina para garantir uma rotina produtiva e confiável.

A importância da limpeza do seu sistema HPLC: acompanho a rotina de grandes laboratórios de cromatografia no Brasil há muitos anos, e a observação atenta da rotina destes lugares revela algo importante: falta cuidado e limpeza nos sistema de cromatografia líquida na maioria destes lugares.

Como causa para esta afirmação temos a rotina extremamente sobrecarregada do uso dos HPLC`s, a falta de conhecimento sobre a importância desta limpeza e sobre como fazer isso de maneira eficiente, além de outras possíveis causas.

Neste post vamos explicar como fazer esta limpeza de maneira extremamente eficiente, aumentando a produtividade e diminuendo o números de reanálises e reinjeções.

Um sistema HPLC sujo pode ser o causador de inúmeros tipos de sintomas:

- aumento da pressão de trabalho devido à entupimentos parciais

em bombas, injetores e detectores;

- ruídos de linha de base e picos não desejados;

- vazamentos e precipitações;

- supressão de picos de interesse;

- entre outros problemas.

A limpeza de um sistema deve ser dividida em 3 situações principais:

- limpeza após uma rotina de análise;

- limpeza ao final do dia;

- limpeza para longos períodos de parada.

Nota importante: neste post estamos considerando o uso de

colunas para fase reversa, a técnica dominante nos dias atuais

quando o assunto é cromatografia líquida. As dicas aqui não são

para limpeza de colunas, mas sim para limpeza de Sistemas HPLC.

Caso sua coluna tenha alguma peculiaridade nos cuidados, siga

atentamente antes de fazer qualquer outro tipo de procedimento.

Antes de tudo, se sua análise utiliza tampões, soluções acidificadas

ou basificadas, troque esta solução por água e passe no sistema por

pelo menos 15 minutos (fluxo e % de solventes do método

utilizado). No caso de gradientes, corra o gradiente inteiro com a

água substituindo o tampão (15 minutos no mínimo). Em seguida,

passe um solvente forte (geralmente ACN ou MeOH) por mais 15

minutos pelo menos (no caso de gradientes corra pelo menos um

gradiente inteiro).

Caso você tenha o uso de equipamentos dedicados (um sistema

HPLC que roda a mesma análise diariamente) e quer manter o

sistema “pronto”, não desligue seu HPLC durante a noite e

mantenha o fluxo de fase móvel em 0,2 mL / min, evitando assim

precipitação e crescimento microbiano. Se seu sistema fica parado

durante a noite, mantenha sempre os canais purgados com solvente

forte (MeOH ou ACN). Caso seu sistema for ficar parado por mais de

5 dias sem uso, é indicado manter o mesmo em solução MeOH: H2O

(50:50).

Dicas práticas:

- se seu laboratório utiliza muito tampão (principalmente tampões

com concentrações acima de 50 mM), é extremamente indicado o

uso de dispositivo de lavagem de selos de bomba, para aumentar a

durabilidade dos selos de pistão (H2O:IPA 90:10);

- mantenha as soluções de uso sempres frescas, trocando-as

regularmente;

- se seu sistema apresenta sais nas conexões (vazamentos), limpe-os

para evitar contaminação de suas injeções;

- atenção com soluções de lavagem de agulha, pois esta deve ser

preferencialmente o seu diluente (atenção com sais e reagentes

agressivos utilizados no seu diluente) ou solvente mais forte, ou a

limpeza da agulha será ineficiente;

- frascos de solventes bem tampados evitam entupimentos dos

filtros pescadores e a evaporação de solventes tóxicos pro

ambiente;

- sempre verifique nível de descarte para evitar derramamentos em

seu laboratório e / ou bancadas.