Os 10 maiores mitos sobre colunas de HPLC - Parte 3

Mito 5:

“Quanto maior a carga de carbono melhor a coluna de fase reversa”

Falso. Parece haver equívocos sobre o papel do comprimento da cadeia, a carga de carbono, cobertura de superfície, e assim por diante, quando se trata das populares fases ligadas de alquilas. Em geral, no mecanismo verdadeiro de fase reversa, onde a retenção é baseada na hidrofobicidade relativa das moléculas do analito, ou seja, a retenção é baseada na carga de carbono, quanto maior a carga de carbono, maior a retenção. A carga de carbono pode ser proporcional ao comprimento da cadeia, mas isso não é necessariamente uma regra. Uma sílica gel típica tem cerca de 8,0 umol /m2 de silanóis reativos que são utilizados para ligações com reagentes organosilanos. Se, por exemplo, para uma dada cobertura de superfície de uma fase ligada com camada simples em umol/m2, quanto maior o comprimento da cadeia, mais carbonos estariam presentes e, portanto, a retenção será proporcional ao comprimento da cadeia. Porém, se uma fase ligada de cadeia mais curta (digamos C8) tiver uma maior cobertura de superfície, teremos mais carbono na superfície e consequentemente maior retenção que uma coluna C18. Além disso, alguns fabricantes utilizam fases ligadas poliméricas (utilizando di e triclororganosilanos), que aumentam a cobertura da fase ligada; ou seja, uma coluna polimérica de cadeia mais curta pode apresentar uma cobertura muito maior que uma fase monomérica de cadeia mais longa. Algumas vezes estas fases poliméricas apresentam uma camada mais espessa da fase ligada, o que resulta numa fase estacionária com uma transferência de massa pior que uma fase ligada monomérica. Colunas de fase reversa altamente carregadas de carbono estão mais propensas ao colapso de fase. Para colunas como essa, quando a quantidade de modificador orgânico cai abaixo de 10% em meio aquoso, estas colunas de fases hidrofóbicas preferir uma auto-associação (colapso de fase) ao invés de estar em uma solução aquosa polar. Assim, nesnta situação, ter uma elevada carga de carbono poderá ser prejudicial para o sucesso da cromatografia de fase reversa e sua reprodutibilidade de tempo de retenção.

Mito 6:

“Sempre se consegue maior eficiência utilizando uma coluna empacotada com partículas menores”

Falso. Embora que para uma coluna bem empacotada a eficiência aumente quando o diâmetro médio de partícula diminui, se os efeitos extra-coluna contribuirem de forma elevada para o aumento do alargamento de banda, o desempenho superior desta coluna não será atingido. Efeitos extra-coluna são todos os volumes adicionais que acontecem no sistema cromatográfico, excluindo-se o próprio empacotamento da coluna. Estes volumes adicionais incluem:

- volume de injeção incluindo o tamanho do loop de injeção como também o volume adicional dentro da válvula(s) de injeção.
- volume do tubo da saída do injetor até a entrada da coluna.
- volume da coluna de guarda (se presente).
- volume do filtro de linha (se presente).
- volume interno de anilhas e parafusos de entrada e saída, incluindo porosidade do frit e canais preferenciais de fluxo.
- volume da tubulação entre a saída da coluna e a entrada do detector.
- volume da tubulação dentro do detector e antes da célula de fluxo.
- volume da célula de fluxo.

Então, você pode minimizar o volume de injeção e manter tubulações curtas e de diâmetros corretos para minimizar esses efeitos extra-colunas, mas se houver uma tubulação de 0,20 polegadas conectando a saída da coluna ao detector, então a largura de banda deve ser grande o suficiente para afetar a eficiência da separação. Por isso, tenha certeza que os efeitos extra-coluna estão minimizados para que você possa conseguir a eficiência esperada de colunas com partículas menores que 2 um ou colunas de menores calibres (1,0 mm de diâmetro interno por exemplo).