Não há nada mais frustrante para um
cromatografista do que chegar no dia seguinte em frente do seu HPLC e perceber
que aquela sêquencia colocada pra rodar no dia anterior foi perdida.
Não importa se era um teste, 5 lotes de
produto final, estabilidade ou uma validação de método, aquele instante da
descoberta é frustrante e a única coisa que queremos saber é o que causou o
problema.
Em geral procuramos por erros grandes
para justificar o problema: uma coluna saturada, uma fase móvel preparada
errada ou um defeito no equipamento.
Mas na maioria das vezes não encontramos
o tal “problema”, e dependendo do nível de compliance da empresa em que você atua,
alguns dias serão perdidos tentando justificar o erro, sem encontrar o real
motivo para o problema.
O que muitos usuários de cromatografia
líquida ainda não perceberam é que em geral, este “problema” grande que estamos
procurando nada mais é do que a somatória de pequenos erros gerados na nossa
rotina de preparação do sistema HPLC para aquela análise.
Nos próximos posts iremos tratar em detalhes quais são os cuidados
que os cromatografistas experientes utilizam em sua rotina para garantir uma
rotina produtiva e confiável.
Qualidade dos solvents / reagentes: a
pureza dos solventes e reagentes utilizados em análises por HPLC / UHPLC é de
extrema importância. Reagentes e solvents grau HPLC são mais caros, mas a
diferença no grau de pureza quando comparado aos de grau P.A. é importante para
o resultado final de sua análise.
Impurezas orgânicas mais apolares tendem
a ficar retidas na coluna de fase reversa e dependendo da composição de fase
móvel, isso pode se acumular na cabeça da coluna cromatográfica, causando
aumento da pressão de trabalho. Se esse contaminante conseguir se deslocar na
coluna durante uma análise isocrática, um ruído de linha da base pode ser
observado. Se este mesmo tipo de contaminante estiver presente numa análise por
gradiente, teremos o aparecimento de picos fantasmas, pois no início do
gradiente a força do solvente é menor e o contaminante ficará retido na cabeça
da coluna; mas com o aumento da força de solvente durante a separação por
gradiente o
contaminante sairá possivelmente na forma de um pico.
Impurezas metálicas podem complexar
dentro da coluna e alterar de forma decisiva a interação entre suas moléculas e
a fase estacionária.
A qualidade da água é outro ponto
fundamental nesta equação, pois a água de má qualidade irá trazer inúmeras
impurezas para sua análise, por isso a água grau HPLC é mandatória. Por outro
lado, a água grau HPLC fica suscetível ao crescimento microbiano, outra fonte
de contaminação.
Não se esqueça de considerar também o
grau de pureza dos sais utilizados no tampão, pois estes são fontes
consideráveis de impurezas da análise cromatográfica.
Outras considerações importantes:
-mantenha frascos de fase móvel fechados
para evitar a contaminação;
-utilize frascos âmbar para água e
tampões, para minimizer o crescimento microbiano;
-água grau HPLC e tampões devem ser
trocados com frequência, devido ao crescimento microbiano;
-evite o uso de frascos plásticos para
fase móvel, pois aditivos adicionados ao plástico podem contaminar sua fase
móvel.
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