Pergunta: Colunas de guarda realmente funcionam ou são apenas chamariz dos fabricantes de coluna ??
Resposta (John Dolan): Colunas de guarda realmente protegem as colunas analíticas de HPLC. Elas atuam de 2 formas principais. Primeiro, elas normalmente tem a mesma porosidade de frit como a coluna analitica, por exemplo, frit de 2 um e partículas de 5 um no material empacotado. Isto faz com que a coluna de guarda retenha toda e qualquer partícula que entupiria a cabeça da coluna analítica. As colunas de guarda também apresentam a mesma composição química das colunas analíticas, então qualquer coisa que possa se ligar irreversivelmente a coluna analítica ficará retida na coluna de guarda.
O truque, é claro, é substituir ou lavar a coluna de guarda antes que ela perca sua função e comece a "sangrar" para dentro da sua coluna analitica. Muitos usuários determinam a vida útil das colunas de guarda pela sua experiência e substituem estas depois de um certo n° de injeções ou determinado n° de dias.
Eu não sou um grande defensor das colunas de guarda. Sim, elas protegem a coluna analítica, mas é muito raro se conseguir um alto n° de pratos teóricos num sistema com coluna de guarda se compararmos com um sistema sem, e elas são bastante caras. A coluna de guarda ajudará a reduzir ou eliminar os resíduos de amostras sujas, mas as colunas de guarda são caras. O que realmente eu não gosto é a relação custo/benefício. Mas é difícil de argumentar em relação ao aumento da vida útil da coluna analítica. A questão é se este ganho é suficiente para justificar este incômodo para você.
Se você optar por usar coluna de guarda, adquira do mesmo fabricante da sua coluna analítica, e manter o mesmo tipo de material empacotado (C18, por exemplo). Você não quer que diferentes interações químicas ocorram na coluna de guarda e na sua coluna analítica - isto pode comprometer sua separação.
quarta-feira, 27 de maio de 2009
quarta-feira, 13 de maio de 2009
Eu preciso mesmo usar Trietilamina ?
Pergunta: Meu supervisor insiste que eu devo adicionar 20 mM de Trietilamina (TEA) em todas as minhas fase móveis para reduzir o efeito cauda., mas eu não vejo o uso de TEA na maioria dos métodos. Ele conhece algum segredo que os outros deveriam saber ?
Resposta (John Dolan): Pelo contrário, ele provavelmente está recomendando o uso de TEA porque ele trabalhou há muitos anos atrás. A função primária da TEA em métodos HPLC de fase reversa é suprimir as interações entre grupos silanóis fortemente ionizados (-Si-OH) presentes na superfície da sílica com analitos alcalinos. Os silanóis ionizados (-Si-O-) serão encharcados pelo excesso de TEA na fase móvel e não vão interagir com os compostos alcalinos e consequentemente não causarão o efeito cauda. O uso de TEA era muito comum nas colunas antigas com sílica de baixa pureza. Estas eram chamadas de Tipo-A ou sílica acidificada. Algumas marcas que podem ser familiares à você são Microbondapak, Nucleosil e Hypersil. Estas marcas de colunas eram as mais utilizadas até o meio da década de 90, mas as colunas de hoje são fabricadas com uma sílica de alta pureza (Tipo-B) que são muito menos acidificadas. Exemplos desta nova tecnologia são as colunas Symmetry, Zorbax StableBond, ACE, e Luna. TEA não é necessário para estas colunas. Eu sou um grande fiel do princípio KISS (Keep It Simple, Stupid) - quanto mais coisas você coloca na fase móvel, mais problemas está querendo arrumar.
Então, respondendo sua pergunta, o que seu chefe recomenda faz muito sentido para as colunas Tipo-A, mas não é mais necessário para as colunas com sílica de alta pureza utilizadas hoje em dia.
Resposta (John Dolan): Pelo contrário, ele provavelmente está recomendando o uso de TEA porque ele trabalhou há muitos anos atrás. A função primária da TEA em métodos HPLC de fase reversa é suprimir as interações entre grupos silanóis fortemente ionizados (-Si-OH) presentes na superfície da sílica com analitos alcalinos. Os silanóis ionizados (-Si-O-) serão encharcados pelo excesso de TEA na fase móvel e não vão interagir com os compostos alcalinos e consequentemente não causarão o efeito cauda. O uso de TEA era muito comum nas colunas antigas com sílica de baixa pureza. Estas eram chamadas de Tipo-A ou sílica acidificada. Algumas marcas que podem ser familiares à você são Microbondapak, Nucleosil e Hypersil. Estas marcas de colunas eram as mais utilizadas até o meio da década de 90, mas as colunas de hoje são fabricadas com uma sílica de alta pureza (Tipo-B) que são muito menos acidificadas. Exemplos desta nova tecnologia são as colunas Symmetry, Zorbax StableBond, ACE, e Luna. TEA não é necessário para estas colunas. Eu sou um grande fiel do princípio KISS (Keep It Simple, Stupid) - quanto mais coisas você coloca na fase móvel, mais problemas está querendo arrumar.
Então, respondendo sua pergunta, o que seu chefe recomenda faz muito sentido para as colunas Tipo-A, mas não é mais necessário para as colunas com sílica de alta pureza utilizadas hoje em dia.
quarta-feira, 6 de maio de 2009
Volume de Pico ?? O que é ? Como calcular ??
Pergunta: O que é volume de pico e como faço para calculá-lo ?
Resposta (John Dolan): O volume de pico é simplesmente o volume de fase móvel na qual o pico elui de uma coluna de HPLC. A maneira mais simples para medir o volume de pico é medir a largura de pico, seja no monitor do computador ou em papel impresso, calculando a base do pico em centímetros. Trace uma linha reta através da base do pico, unindo a linha de base antes e depois do pico. Em seguida, trace as tangentes dos lados dos picos até a intersecção das tangentes com a linha de base traçada. A distância entre esses dois pontos de intersecção é a largura de pico, que pode ser medido em unidades de tempo. Converta o tempo para volume multiplicando a largura de pico pela taxa de fluxo. Então se a amplitude do pico é 0,345 min e o fluxo é de 2 mL/min, o volume de pico é (2 x 0,345) = 0,690 mL. Claro que seu sistema de dados já fornece a largura de pico, você pode simplesmente multiplicar este número pelo fluxo e pular a construção das tangentes.
Resposta (John Dolan): O volume de pico é simplesmente o volume de fase móvel na qual o pico elui de uma coluna de HPLC. A maneira mais simples para medir o volume de pico é medir a largura de pico, seja no monitor do computador ou em papel impresso, calculando a base do pico em centímetros. Trace uma linha reta através da base do pico, unindo a linha de base antes e depois do pico. Em seguida, trace as tangentes dos lados dos picos até a intersecção das tangentes com a linha de base traçada. A distância entre esses dois pontos de intersecção é a largura de pico, que pode ser medido em unidades de tempo. Converta o tempo para volume multiplicando a largura de pico pela taxa de fluxo. Então se a amplitude do pico é 0,345 min e o fluxo é de 2 mL/min, o volume de pico é (2 x 0,345) = 0,690 mL. Claro que seu sistema de dados já fornece a largura de pico, você pode simplesmente multiplicar este número pelo fluxo e pular a construção das tangentes.
quarta-feira, 29 de abril de 2009
Dicas - Removendo Tampões
Pergunta: Qual é a forma correta de lavar uma coluna de fase reversa após usar uma fase móvel composta por tampão: orgânico ? Por exemplo, se eu tenho uma fase móvel (60:40) metanol: tampão (25 mM de fosfato), qual é a melhor maneira de lavar a coluna após a utilização?
John Dolan responde: Existem várias maneiras para se lavar uma coluna. A preocupação quando estamos lavando uma coluna utilizada com tampão é que nós não queremos precipitar o sal dentro coluna. Portanto, a maneira mais segura de se livrar do tampão é substituí-lo por água e utilizar a mesma composição de fase móvel para a primeira lavagem. Para o caso acima, devemos começar a lavagem com (60:40) metanol:água durante alguns minutos (pelo menos 5 min num fluxo de 1-2 mL/min) e, em seguida, ir até 100% de metanol (MeOH), para retirar materiais fortemente retidos na coluna. Com MeOH, uma mudança de sua fase móvel tamponada direto para MeOH provavelmente não é uma preocupação muito grande, porque tampões são bastante solúveis em MeOH. Mas se você utilizar acetonitrila (ACN), onde os tampões apresentam solubilidade muito mais baixa, é possível precipitar o tampão, e esta é uma má notícia.
Outra maneira de lavar a coluna é apenas utilizar 100% de água por alguns minutos antes de se mudar para 100% orgânico. Alguns usuários rejeitam esta ideia, em virtude do fenômeno conhecido como "colapso de coluna", onde em presença de 100% de água, esta é forçada a sair dos poros da coluna. Isto pode acontecer, mas o meu palpite é que a maior parte do tampão é retirado antes que isso aconteça. Se após a lavagem com 100% de água você lavar a coluna com um solvente forte (100% orgânica), a coluna será reequilibrada, e não deve haver problema. Esta maneira é simples, e pode ser mais fácil de automatizar num HPLC.
Revisando, a chave para lavagem de uma coluna após o uso de tampão é remover o tampão, de modo que não haja risco de precipitação e, em seguida, lavar com 100% orgânico para remover o material fortemente retido. Se você tiver a infeliz experiência de precipitar o tampão, o melhor é jogar fora a coluna - retirar o tampão precipitado dos poros da coluna é quase impossível.
John Dolan responde: Existem várias maneiras para se lavar uma coluna. A preocupação quando estamos lavando uma coluna utilizada com tampão é que nós não queremos precipitar o sal dentro coluna. Portanto, a maneira mais segura de se livrar do tampão é substituí-lo por água e utilizar a mesma composição de fase móvel para a primeira lavagem. Para o caso acima, devemos começar a lavagem com (60:40) metanol:água durante alguns minutos (pelo menos 5 min num fluxo de 1-2 mL/min) e, em seguida, ir até 100% de metanol (MeOH), para retirar materiais fortemente retidos na coluna. Com MeOH, uma mudança de sua fase móvel tamponada direto para MeOH provavelmente não é uma preocupação muito grande, porque tampões são bastante solúveis em MeOH. Mas se você utilizar acetonitrila (ACN), onde os tampões apresentam solubilidade muito mais baixa, é possível precipitar o tampão, e esta é uma má notícia.
Outra maneira de lavar a coluna é apenas utilizar 100% de água por alguns minutos antes de se mudar para 100% orgânico. Alguns usuários rejeitam esta ideia, em virtude do fenômeno conhecido como "colapso de coluna", onde em presença de 100% de água, esta é forçada a sair dos poros da coluna. Isto pode acontecer, mas o meu palpite é que a maior parte do tampão é retirado antes que isso aconteça. Se após a lavagem com 100% de água você lavar a coluna com um solvente forte (100% orgânica), a coluna será reequilibrada, e não deve haver problema. Esta maneira é simples, e pode ser mais fácil de automatizar num HPLC.
Revisando, a chave para lavagem de uma coluna após o uso de tampão é remover o tampão, de modo que não haja risco de precipitação e, em seguida, lavar com 100% orgânico para remover o material fortemente retido. Se você tiver a infeliz experiência de precipitar o tampão, o melhor é jogar fora a coluna - retirar o tampão precipitado dos poros da coluna é quase impossível.
segunda-feira, 2 de fevereiro de 2009
Análise de aminoácidos - Visão Geral - Parte 1
Análise de aminoácidos – Visão Geral
As análises de aminoácidos envolvem as metodologias utilizadas para determinar a composição ou conteúdo de aminoácidos de proteínas, peptídeos, e outras preparações farmacêuticas. A análise de aminoácidos é muito utilizada em laboratórios de análises clínicas, bioquímicas e indústria de processamento de alimentos. Ela tem sido estudada durante os últimos 30 anos, diversos métodos foram desenvolvidos e tem sido utilizados, cada qual com características próprias, vantagens e desvantagens que se aplicam a cada grupo de interesses específicos. Proteínas e Peptídeos são macromoléculas formadas por aminoácios covalentemente ligados e organizados como um polímero linear. A sequência de aminoácidos nas proteínas ou peptídeos determina as propriedades da molécula. As proteínas são consideradas moléculas grandes, enquanto os peptídeos são menores e contituídos por poucos aminoácidos. As análises de aminoácidos podem ser utilizadas para quantificar proteínas e peptídeos, para identificar proteínas e peptídeos baseado em sua composição de aminoácidos, para análise estrutural de proteínas e peptídeos, para avaliar estratégias de fragmentação para mapeamento de peptídeos, e para identificar aminoácidos atípicos que podem estar presentes numa proteína ou peptídeo. É necessário hidrolisar uma proteína/peptídeo antes de realizar a análise de aminoácidos. Após a hidrólise, os procedimentos da análise de aminoácidos podem ser os mesmos utilizados para aminoácidos livres em outras preparações farmacêuticas. Os aminoácidos constituintes da amostra são tipicamente derivatizados para a análise. O objetivo da derivatização é aumentar a sensibilidade de detecção e a seletividade da separação. Como o número de aminoácidos de interesse é grande e possuem estruturas químicas muito semelhantes, é necessário a utilização de gradiente de fase móvel (normalmente composta por tampão fosfato e acetonitrila).
Um parâmetro limitante que permanece no desenvolvimento da análise de aminoácidos é a confiança na preparação dos hidrolisados protéicos para o método cromatográfico, principalmente quanto à eliminação dos reagentes da hidrólise. A neutralização ou evaporação dos agentes hidrolíticos é importante fator de discussão. O alto teor de sal resultante da neutralização, levado para a coluna de troca iônica, produz alargamento dos picos e não pode ser aplicado a todas as resinas, enquanto que a evaporação até a secagem pode acarretar perdas na recuperação dos aminoácidos durante esse procedimento. O método mais comumente empregado para a eliminação dos reagentes da hidrólise é o da utilização de evaporadores rotativos sob vácuo. Entretanto, para grandes quantidades de amostras torna-se um ponto crítico, pela morosidade e necessidade de acompanhamento contínuo, transformando-se em condição de estrangulamento e demora na análise.
Para diminuir o tempo na evaporação de amostras foram propostos procedimentos utilizando sistemas de evaporação para várias amostras simultâneas. Um tratamento alternativo, utilizado em muitos laboratórios, baseia-se na remoção dos reagentes em dessecadores ou câmaras a vácuo em presença de pastilhas de hidróxido de sódio e/ou pentóxido de fósforo.Os métodos utilizados para análise de aminoácidos são usualmente baseados na técnica de separação cromatográfica de aminoácidos presentes na amostra. As técnicas atuais de análise levam vantagem devido aos excelentes níveis de automatização dos equipamentos de HPLC. A análise de aminoácidos necessita normalmente de HPLC’s capazes de gerar gradientes de fase móvel para separar os aminoácidos na coluna cromatográfica. O instrumento deve ter sistema de derivatização póscoluna, ao menos se a amostra for analisada utilizando derivatização précoluna. O detector comumente utilizado é um UV-Vis ou Fluorescência dependendo do método de derivatização utilizado. Um dispositivo de registro faz-se necessário, como por exemplo um registrador ou software para transformar o sinal do detector e para quantificação. É recomendado também dedicar o equipamento somente para análise de aminoácidos.
Fonte: Farmacopéia Japonesa, artigos internacionais e nacionais.
As análises de aminoácidos envolvem as metodologias utilizadas para determinar a composição ou conteúdo de aminoácidos de proteínas, peptídeos, e outras preparações farmacêuticas. A análise de aminoácidos é muito utilizada em laboratórios de análises clínicas, bioquímicas e indústria de processamento de alimentos. Ela tem sido estudada durante os últimos 30 anos, diversos métodos foram desenvolvidos e tem sido utilizados, cada qual com características próprias, vantagens e desvantagens que se aplicam a cada grupo de interesses específicos. Proteínas e Peptídeos são macromoléculas formadas por aminoácios covalentemente ligados e organizados como um polímero linear. A sequência de aminoácidos nas proteínas ou peptídeos determina as propriedades da molécula. As proteínas são consideradas moléculas grandes, enquanto os peptídeos são menores e contituídos por poucos aminoácidos. As análises de aminoácidos podem ser utilizadas para quantificar proteínas e peptídeos, para identificar proteínas e peptídeos baseado em sua composição de aminoácidos, para análise estrutural de proteínas e peptídeos, para avaliar estratégias de fragmentação para mapeamento de peptídeos, e para identificar aminoácidos atípicos que podem estar presentes numa proteína ou peptídeo. É necessário hidrolisar uma proteína/peptídeo antes de realizar a análise de aminoácidos. Após a hidrólise, os procedimentos da análise de aminoácidos podem ser os mesmos utilizados para aminoácidos livres em outras preparações farmacêuticas. Os aminoácidos constituintes da amostra são tipicamente derivatizados para a análise. O objetivo da derivatização é aumentar a sensibilidade de detecção e a seletividade da separação. Como o número de aminoácidos de interesse é grande e possuem estruturas químicas muito semelhantes, é necessário a utilização de gradiente de fase móvel (normalmente composta por tampão fosfato e acetonitrila).
Um parâmetro limitante que permanece no desenvolvimento da análise de aminoácidos é a confiança na preparação dos hidrolisados protéicos para o método cromatográfico, principalmente quanto à eliminação dos reagentes da hidrólise. A neutralização ou evaporação dos agentes hidrolíticos é importante fator de discussão. O alto teor de sal resultante da neutralização, levado para a coluna de troca iônica, produz alargamento dos picos e não pode ser aplicado a todas as resinas, enquanto que a evaporação até a secagem pode acarretar perdas na recuperação dos aminoácidos durante esse procedimento. O método mais comumente empregado para a eliminação dos reagentes da hidrólise é o da utilização de evaporadores rotativos sob vácuo. Entretanto, para grandes quantidades de amostras torna-se um ponto crítico, pela morosidade e necessidade de acompanhamento contínuo, transformando-se em condição de estrangulamento e demora na análise.
Para diminuir o tempo na evaporação de amostras foram propostos procedimentos utilizando sistemas de evaporação para várias amostras simultâneas. Um tratamento alternativo, utilizado em muitos laboratórios, baseia-se na remoção dos reagentes em dessecadores ou câmaras a vácuo em presença de pastilhas de hidróxido de sódio e/ou pentóxido de fósforo.Os métodos utilizados para análise de aminoácidos são usualmente baseados na técnica de separação cromatográfica de aminoácidos presentes na amostra. As técnicas atuais de análise levam vantagem devido aos excelentes níveis de automatização dos equipamentos de HPLC. A análise de aminoácidos necessita normalmente de HPLC’s capazes de gerar gradientes de fase móvel para separar os aminoácidos na coluna cromatográfica. O instrumento deve ter sistema de derivatização póscoluna, ao menos se a amostra for analisada utilizando derivatização précoluna. O detector comumente utilizado é um UV-Vis ou Fluorescência dependendo do método de derivatização utilizado. Um dispositivo de registro faz-se necessário, como por exemplo um registrador ou software para transformar o sinal do detector e para quantificação. É recomendado também dedicar o equipamento somente para análise de aminoácidos.
Fonte: Farmacopéia Japonesa, artigos internacionais e nacionais.
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