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segunda-feira, 2 de fevereiro de 2009

Análise de aminoácidos - Visão Geral - Parte 1

Análise de aminoácidos – Visão Geral

As análises de aminoácidos envolvem as metodologias utilizadas para determinar a composição ou conteúdo de aminoácidos de proteínas, peptídeos, e outras preparações farmacêuticas. A análise de aminoácidos é muito utilizada em laboratórios de análises clínicas, bioquímicas e indústria de processamento de alimentos. Ela tem sido estudada durante os últimos 30 anos, diversos métodos foram desenvolvidos e tem sido utilizados, cada qual com características próprias, vantagens e desvantagens que se aplicam a cada grupo de interesses específicos. Proteínas e Peptídeos são macromoléculas formadas por aminoácios covalentemente ligados e organizados como um polímero linear. A sequência de aminoácidos nas proteínas ou peptídeos determina as propriedades da molécula. As proteínas são consideradas moléculas grandes, enquanto os peptídeos são menores e contituídos por poucos aminoácidos. As análises de aminoácidos podem ser utilizadas para quantificar proteínas e peptídeos, para identificar proteínas e peptídeos baseado em sua composição de aminoácidos, para análise estrutural de proteínas e peptídeos, para avaliar estratégias de fragmentação para mapeamento de peptídeos, e para identificar aminoácidos atípicos que podem estar presentes numa proteína ou peptídeo. É necessário hidrolisar uma proteína/peptídeo antes de realizar a análise de aminoácidos. Após a hidrólise, os procedimentos da análise de aminoácidos podem ser os mesmos utilizados para aminoácidos livres em outras preparações farmacêuticas. Os aminoácidos constituintes da amostra são tipicamente derivatizados para a análise. O objetivo da derivatização é aumentar a sensibilidade de detecção e a seletividade da separação. Como o número de aminoácidos de interesse é grande e possuem estruturas químicas muito semelhantes, é necessário a utilização de gradiente de fase móvel (normalmente composta por tampão fosfato e acetonitrila).
Um parâmetro limitante que permanece no desenvolvimento da análise de aminoácidos é a confiança na preparação dos hidrolisados protéicos para o método cromatográfico, principalmente quanto à eliminação dos reagentes da hidrólise. A neutralização ou evaporação dos agentes hidrolíticos é importante fator de discussão. O alto teor de sal resultante da neutralização, levado para a coluna de troca iônica, produz alargamento dos picos e não pode ser aplicado a todas as resinas, enquanto que a evaporação até a secagem pode acarretar perdas na recuperação dos aminoácidos durante esse procedimento. O método mais comumente empregado para a eliminação dos reagentes da hidrólise é o da utilização de evaporadores rotativos sob vácuo. Entretanto, para grandes quantidades de amostras torna-se um ponto crítico, pela morosidade e necessidade de acompanhamento contínuo, transformando-se em condição de estrangulamento e demora na análise.
Para diminuir o tempo na evaporação de amostras foram propostos procedimentos utilizando sistemas de evaporação para várias amostras simultâneas. Um tratamento alternativo, utilizado em muitos laboratórios, baseia-se na remoção dos reagentes em dessecadores ou câmaras a vácuo em presença de pastilhas de hidróxido de sódio e/ou pentóxido de fósforo.Os métodos utilizados para análise de aminoácidos são usualmente baseados na técnica de separação cromatográfica de aminoácidos presentes na amostra. As técnicas atuais de análise levam vantagem devido aos excelentes níveis de automatização dos equipamentos de HPLC. A análise de aminoácidos necessita normalmente de HPLC’s capazes de gerar gradientes de fase móvel para separar os aminoácidos na coluna cromatográfica. O instrumento deve ter sistema de derivatização póscoluna, ao menos se a amostra for analisada utilizando derivatização précoluna. O detector comumente utilizado é um UV-Vis ou Fluorescência dependendo do método de derivatização utilizado. Um dispositivo de registro faz-se necessário, como por exemplo um registrador ou software para transformar o sinal do detector e para quantificação. É recomendado também dedicar o equipamento somente para análise de aminoácidos.

Fonte: Farmacopéia Japonesa, artigos internacionais e nacionais.

43 Comentários:

Blogger André LW Santos disse...

Caro Ronaldo
Parabéns pelo blog, e pela qualidade dos textos. Com certeza vai ajudar quem está começando bem como aqueles com experiência no assunto. Eu li num post anterior que vc está planejando um curso sobre HPLC (confere?). Já tem uma previsão de data? Eu andei pesquisando sobre os cursos da Waters em HPLC, mas achei os preços "salgados" para um mero estudante universitário.

7 de fevereiro de 2009 08:58

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

É isso mesmo André !! Estou elaborando um curso sim, mas ainda preciso formar um bom grupo de interessados para que possamos fazer algo bacana. Por favor ajude na divulgação do blog para que o quanto antes posssamos realizar um bom treinamento.
Abraço,

9 de fevereiro de 2009 02:33

 
Blogger Vani disse...

Olá Ronaldo!!
Muito Obrigada pelo texto.
De otima ajuda e um texto bem simples e explicativo..
Agradeço!!

17 de fevereiro de 2009 14:22

 
Blogger Sanclayver Araújo disse...

Gostaria de parabenizar o idealizador do BLOG. Muito legal.
Gostaria de saber onde posso encontrar mais material sobre análise de proteínas por HPLC.
obrigado

1 de março de 2009 06:22

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Obrigado pelo elogio Sanclyver, o objetivo do blog é a divulgação e troca de conhecimentos na área de HPLC. Sobre análise de proteínas, existe realmente pouco material em Português, mas em inglês você consegue bom conteúdo. Caso tenha algum assunto oou aplicação específica, escreva novamente aqui que vejo se elaboro mais material.
Abraço

2 de março de 2009 01:39

 
Blogger Manu disse...

Olááááá
estou desenvolvendo uma metodologia para doseamento de aminoácidos (já livres), estou usando a técnica de derivatização pré coluna com PITC...mas não tenho o speed-vac para remoção do reagente...vc teria alguma sugestão??
grata....

2 de abril de 2009 16:28

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Olá Manu, sinceramente não conheço nenhuma alternativa pra se trabalhar sem o speed-vac, mas posso indicar outra técnica: você já usou ou pensou em usar AQC ?? Para a análise de aminoácidos primários e secundários essa técnica apresenta excelentes resultados, com muitas vantagens sobre o PITC. Caso você tenha interesse, me escreva no e-mail: ronaldo@chromaservice.com.br que posso te passar um material sobre o assunto.
Abraço,
Ronaldo.

3 de abril de 2009 06:46

 
Blogger Clarissa disse...

Olá Ronaldo, parabéns pelo blog!!! Estou precisando de ajuda. Trabalho num laboratório e nós estamos interessados em comprar um HPLC para dosagem de aminoácidos (glutamina). Gostaria de obter algumas informações sobre qual aparelho, preço, técnica..... Posso falar com você por email? Desde já, obrigada.

6 de maio de 2009 18:41

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Claro que pode Clarissa, fique à vontade em me escrever e vou tentar te ajudar com o maior prazer.
Abraço

7 de maio de 2009 05:53

 
Blogger Clarissa disse...

Olá Ronaldo, bom dia. Inicialmente, eu gostaria de saber se você tem noção do valor do equipamento, colunas, aonde eu posso ver isso. Já fiz alguns contatos mas ainda não recebi resposta. Você foi o único que me respondeu. E se vale a pena comprar um equipamento ou fazer uma parceria com outro laboratório. Eu dosei no meu mestrado aminoácidos, mas como não tínhamos no laboratório, encaminhei minhas amostras para Inglaterra pois tínhamos uma parceria lá. Fui para outro laboratório, e o chefe não tem parceria, por isso ele pensou em comprar. Tenho conhecimento de que é uma técnica difícil, você tem alguma referência para me indicar aonde eu possa entender um pouco da técnica, pelo menos para passar rapidamente para o meu chefe. Muito obrigada pela atenção. Um abraço, Clarissa

7 de maio de 2009 07:47

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Olá novamente Clarissa, vamos à algumas considerações:

A análise de aminoácidos realmente tem uma fama de não ser uma das mais fáceis, mas essa fama se deve basicamente devido ao pré-tratamento da amostra, pois normalmente não temos aminoácidos livres para analisar e sim proteínas ou ainda alimentos como carnes e grãos. Quanto mais complexa a amostra maior e mais complicado é o isolamento do aminoácido de interesse (muitas vezes não conseguimos isolá-lo totalmente).

Sobre a aquisição de um equipamento, essa tomada de decisão deve ser bem avaliada, pois você deve ter uma quantidade considerável de amostras com uma frequência considerável para justificar a aquisição. Esse cálculo deve ser feito baseado no n° de análises que você possui, gastos com analistas, reagentes, padrões, manutenção periódica do equipamento mais o custo do próprio equipamento e comparar todas essas informações com a tercerização de análise. Uma pessoa na área administrativa saberá com mais propriedade calcular para você o custo/benefício da aquisição, pois o equipamento tem uma depreciação do seu valor e isso também é levado em consideração. Uma solução encontrada por alguns dos meus clientes que possuem HPLC e este fica ocioso é se tornar um laboratório de terceirização de análise.

Atualmente no mercado você vai encontrar diversas marcas de equipamento, mas infelizmente a maioria delas não possui um pós-venda (manutenção e qualificação) de qualidade, por isso é importante, antes de fechar qualquer negócio, levar em consideração se a empresa possui outros clientes no Brasil, qual o tamanho da sua base instalada, se possui estoque de peças aqui no Brasil e se tem técnicos qualificados pelo fabricante para dar manutenção no equipamento.

Eu particularmente posso te indicar os equipamentos com que trabalhei, que são da marca Waters e Agilent, dando ênfase aos da Waters pois além de ter trabalhado como usuário eu trabalhei na própria Waters durante 4 anos e hoje presto serviço nessa linha de equipamentos.

Quanto ao preço, é muito relativo pois depende dos acessórios e detectores que você vai precisar, mas acho que você vai começar a encontrar sistemas na faixa dos US $ 30.000 e daí pra cima. Posso citar como outras marcas os equipamentos da Merck, Shimadzu, Varian, Thermo, Perkin Elmer, entre outros. A maneira mais fácil de entrar em contato com esses fabricantes é pelo seus respectivos sites e procurar pelos seus representantes no Brasil. Caso tenha dificuldade me avise que vejo o que posso fazer pra você.

Qualquer coisa é só escrever.
Abraço

7 de maio de 2009 09:36

 
Blogger Fernanda disse...

Olá ronaldo! Gostaria de parabenizá-lo pela iniciativa do blog!
Estou trabalhando com a metodologia para analisar aminiácidos pelo PITC. Esse método, patentiado pela waters utiliza oriinalmente uma coluna C18 3.9x 150 mm, eu poderia substituir essa por uma C18 250x4 mm?

7 de maio de 2009 13:29

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Oi Fernanda, é muito importante destacar que diferentes marcas de colunas apresentam diferenças na purificação e tratamento da sílica, por isso preciso de mais informações sobre suas colunas (marca, tamanho de partícula, forma da partícula e se possui algum tratamento (end capping, bridge, etc). Caso você esteja fazendo somente a mudança do comprimento e mantendo todas as outras características, como vantagem você terá uma separação mais eficiente (mais pratos teóricos), mas seu tempo de corrida também deve aumentar.
Abraço

8 de maio de 2009 06:27

 
Blogger Clarissa disse...

Olá Ronaldo, passarei todas essas informações para o chefe do meu laboratório. Muito obrigada pela atenção e mais uma vez, parabéns pelo blog. Um abraço.

8 de maio de 2009 13:03

 
Blogger Joel disse...

Olá Ronaldo!!
Meus parabéns pelo blog!! definitivamente foi uma ótima iniciativa.
Sou formado em química e tenho um grande fascínio por esta técnica(HPLC) embora nunca tenha trabalhado com ela, mas gostaria muito de aprender, portanto, se vc tiver algum material, para leigos, que possa diponibiliza-lo gostaria muito de recebe-lo.
Tbm tenho grande interesse no curso pode contar comigo.
obrigado

25 de maio de 2009 08:44

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Valeu pelo apoio Joel !! Estou organizando material sobre o assunto e assim que termiar vou disponibilizar alguns resumos e material para leigos. Dentro de mais 15 dias terei o material do treinamento básico finalizado e com certeza divulgarei pra você também.
Abraço

25 de maio de 2009 09:19

 
Blogger Anderson disse...

Ronaldo
Muito legal teu blog. Trabalho em Porto Alegre à quatro anos dosando aminoácidos por HPLC (fluorescência). Estou me formando em Biomedicina agora no final do ano, e meu TCC será sobre o trabalho que faço no HCPA. Onde eu posso achar informações sobre o método?
Abs

26 de maio de 2009 18:07

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Valeu Anderson !! Cara material sobre cromatografia é vasto na internet, mas você precisa procurar em Inglês. Tenho aluns artigos savosno meu PC, e se você me assar seu e-mail eu posso te ajudar um pouco.
Abraço

27 de maio de 2009 05:38

 
Blogger Anderson disse...

Ronaldo,

me passa se puderes então. andersonbuker@gmail.com

Abs

27 de maio de 2009 14:18

 
Blogger Érica disse...

Caro Ronaldo! parabéns pelo blog! apresento meu TCC esta semana e estou com uma dúvida pois já faz um tempinho que não tenho contato com a técnica. No meu trabalho, a dosagem de glicina foi feita num laboratório terceiro utilizando coluna de fase reversa, sendo que a eluição por gradiente foi realizada usando acetato de sódio, EDTA e acetonitrila. Não consigo explicar como a glicina (polar) foi retida pela coluna (apolar). Além disso, a amostra foi derivatizada utilizando uma solução com PITC e outra sem. O que isso significa? Obrigada
Érica

7 de junho de 2009 16:09

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Olá Érica,

Baseado nas informações superficiais, posso te explicar o princípio da técnica, pois para te dar todos os detalhes é necessário informações como pH de fase, qual o pKa da glicina, qual exatamente é o tipo da coluna de fase reversa, composição de F.M., entre outras.
O princípio de análise com PITC (fenilisotiocianato) é o seguinte: o PITC reage com o aminoácido formando PTC (feniltiocarbamil), este sendo detectado por UV à 245 nm (alta sensibilidade). Esta derivação é feita "pré-coluna". A separação do analito de interesse ocorre pela combinação entre as concentrações de tampão e acetonitrila. O tampãp a ser utilizado depende exatamente do analito e seu pKa, para que possamos controlar a ionização do mesmo. Quanto a polaridade do analito e a apolaridade da coluna, isto é controlado exatamente pela fase móvel e fase estacionária, pois as possibilidades são quase infinitas. Sobre a amostra sem PITC, desconheço como ela foi analisada, pois aminoácidos e proteínas normalmente devem ser derivados para se conseguir resposta em detectores UV, pode ser que tenham utilizado outro tipo de detecção.
Espero ter ajudado. Abraço,

8 de junho de 2009 06:24

 
Blogger Paula disse...

Olá Ronaldo!!!
Parabéns pelo blog, sou estudante de veterinária e faços parte de um grupo de pesquisa em metabolismo animal. Seu blog foi muito esclarecedor para o que estamos pesquisando neste momento. Gostaria de saber se é possível dosear fosfato, e seu método.
Obrigado pela atenção

14 de junho de 2009 18:21

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Olá Paula,

Obrigado pelos elogios, o objetivo é divulgar e trocar informações sobe a técnica. obre sua pergunta, preciso de mais informações para poder te ajudar. Não sou especialista na sua área, mas fosfatos são sais que podem sim serem analisados por HPLC, mas precisaria saber que sais de fosfato são esses, pois muitas propriedades físico-químicas da molécula influenciam no tipo de técnica a ser utilizada.
Um abraço,

15 de junho de 2009 06:27

 
Blogger Paula disse...

Oii Ronado... obrigado por responder. A molécula que gostariamos de medir é Butafosfan, é composto organico do ácido fósforio, sendo sua forma molecular C7H17NO2P.É um fármaco que possui poucos estudos sobre bua biodisponibilidade e metabolização.
Vou esutdar sobre a análise de sais de fósforo.
Se tiver mais informações de como poder ser mensuarado agradeço.

15 de junho de 2009 09:37

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Oi Paula,
Vou dar uma olhada no que acho pesquisando na net e te falo, mas caso consiga algo vams conversando sem problemas.
Abraço

15 de junho de 2009 10:22

 
Blogger Paula disse...

Oiii...Valeu!!!
Entro em contato

16 de junho de 2009 12:53

 
Blogger Luiz disse...

Caro Ronaldo,

Parabéns ñ só pelo blog mas principalmente pela sua disponibilidade em esclarecer as dúvidas e sua contribuição científica. Sou estudante de Mestrado (UFMG) e utilizarei a técnica para medir monoaminas cerebrais. O equipamento já está há algum tempo parado, então gostaria de saber se é necessário alguma medida preventiva para a utilização.

24 de fevereiro de 2010 04:41

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Olá Luiz,

Obrigado pelos elogios !

Bom, sobre sua dúvida, um HPLC parado sem uso nunca é bom, pois o acúmulo de pó em placas, os canais de solvente secos e outros problemas gerados pela falta de uso causam problema ao seu sistema HPLC. O importante agora é ligar os módulos que compõem o sistema (observar se eles passam no auto-diagnóstico), fazer uma purga em todos os canais com solvente orgânica (MeOH ou ACN) e passar fluxo pelo sistema por pelo menos 10 minutos e observar atentamente qualquer barulho, vazamento e qualquer anomalia. Após esse passo inicial, o indicado é rodar uma análise com metodologia validada, pois a adequabilidade do sistema dessa metodologia seria um bom teste inicial para garantirmos que está tudo em ordem no seu HPLC. Caso você não tenha uma netodologia validada, um padrão qualquer de cromatograma conhecido pode ajudar, fazendo 6 injeções consecutivas e obtendo um % DPR de área < 2%.
Indico à você que caso o seu HPLC não tenha muito uso, é indicado pelo menos 1 vez por semana ligar todo o sistema, purgar todos os canais com solvente orgânico, para evitar sustos na próxima utilização.

Um abraço,

25 de fevereiro de 2010 12:04

 
Blogger Joyce disse...

Olá Ronaldo, estou tentando utilizar a técnica de derivatização pré coluna com PITC para determinação de aminoacidos. Já encontrei várias metodologias utilizando aquecimento da coluna. Isto realmente é necessário para a separação dos aminoacidos? Outro ponto, não tenho o speed-vac para remoção do reagente ísto é muito critico? O que seria AQC?

5 de novembro de 2010 11:18

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Olá Joyce,

Demorei pois tive que buscar um pouco de informação para te responder, pois aminoácidos não é minha área de atuação, mas vamos às respostas:

Realmente vi algumas citações de temperatura, mas na Farmacopéia Japonesa (uso bastante como fonte de informações), ela não cita temperatura no uso do método com PITC. O importante é uma temperatura estável, pois como os componentes são bastante similares, qualquer oscilação da temperatura poderá comprometer a separação cromatográfica, por isso sempre indico o uso de uma temperatura do forno de colunas no mínimo 5°C acima da temperatura do seu laboratório. Até onde pude me aprofundar, o speed-vac é indispensável sim, mas se vc conseguir concentrar essa amostra de uma outra maneira sem degradar seus analitos acho que você pode tentar sim. O AQC é a abreviação em inglês do composto 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate, usado na derivatização pré-coluna e depois detectado por fluorescência. Caso você queira mais informações, me mande um e-mail e eu te encaminho mais informações sobre essa técnica.

Abraço,

Ronaldo

10 de novembro de 2010 06:59

 
Blogger Luiz de Oliveira disse...

Boa tarde Ronaldo,

sou um inciante na técnica de HPLC e na minha empresa me pediram pra indicar a compra de HPLC com um detector amperométrico. Qual marca/modelo você me indicaria?

Abraço!

19 de janeiro de 2011 07:12

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Olá Luis,

O uso de detectores eletroquímicos (amperométricos/coulométricos) são específicas, por isso é importante avaliar a necessidade e se sua análise não apresenta bons resultados em outras técnicas de detecção (UV/Vis ou Flourescência por exemplo). Caso necessite realmente da compra, as marcas que conheço que tem detector eletroquímico são a Waters e a Dionex, sendo esta última quase que unânimidade em relação a qualidade do detector. Quanto à modelo, não sei te informar, sei que a Waters só possui o modelo 2465, e é o mesmo há pelo menos 15 anos. Entre em contato com esses fabricantes e avalie.

Boa sorte e qualquer dúvida, nos escreva.

Abraço,

Ronaldo

20 de janeiro de 2011 04:45

 
Blogger Luana Batalha disse...

Procuro por cursos em HPCL, Espectofotometria, Absorção
Vocês poderiam me indicar alguma empresa? Tenho interesse em atuar como Analista de Laboratório e Controle, mas a maioria das vagas exigem conhecimento neste assunto.

Abraços

Luana

25 de julho de 2011 05:52

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Olá Luana,

Realmente o conhecimento em instrumental é bastante exigido, mas acho injusto cobrar isso de alguém que acaba de sair da universidade ou técnico.

Com relação aos cursos, indico à você os fabricantes de equipamentos, como Agilent, Waters, Varian, Perkin Elmer, entre outros. Destaco os cursos da Agilent, por ter uma estrutura bastante sólida e instrutores com conhecimento acima da média do mercado. Você pode entrar no site deles e pegar um telefone para contato. Com relação ao preço do curso, encare como um investimento e um diferencial para seu Currículo, pois normalmente não são muito baratos.

Boa sorte e muito sucesso !!

Ronaldo

25 de julho de 2011 06:10

 
Blogger A QUIMICA E SUAS APLICAÇÕES disse...

Ronaldo....

estou trabalhando num projeto de pesquisa de determinaçao de aminoácidos por cromatografia. Não consegui achar seu e mail..se puderes mandar e mail para mim te retorno com algumas perguntas....ok?
gm.rodrigues@uol.com.br
mariano

23 de abril de 2012 09:51

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

E-mail enviado amigo, vamos conversando.

Abraço,

Ronaldo

26 de abril de 2012 19:28

 
Blogger alvanice disse...

Ronaldo, parabéns pelo blog, é muito bom mesmo! Esclareceu muitas dúvidas que eu tinha sobre o tema HPLC. Gostaria de saber onde posso encontrar material sobre procedimentos de preparação de amostras de pólen para determinação de aminoácidos por HPLC.

1 de fevereiro de 2014 09:22

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Olá Alvanice,

Obrigado pelo seu contato !! Dei uma procurada no google e não encontrei nada para te ajudar. Infelizmente nunca trabalhei com este tipo de matriz. Sinto muito não poder te ajudar.

Um abraço !!

Ronaldo

1 de fevereiro de 2014 11:46

 
Blogger alvanice disse...

Ronaldo, mesmo você não tendo nenhum material sobre o solicitado, agradeço pela presteza.

3 de fevereiro de 2014 10:00

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Boa noite Alvanice,

Achei um material que pode te ajudar, pois trata de tratamento de algumas matrizes para a análise de aminoácidos, Me mande um e-mail em cromatografia.rbn@gmail.com

Abraço,

Ronaldo

4 de fevereiro de 2014 17:51

 
Blogger Anna Jacinta disse...

Estou com o mesmo problema de Alvanice Ronaldo...poderia me enviar o material sobre análise de pólen?

18 de março de 2014 13:55

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Olá Anna,

Estou te enviando o material solicitado.

Boa sorte !!

Ronaldo

19 de março de 2014 05:31

 
Blogger Ronaldo Buissa Netto disse...

Olá Anna,

Por gentileza, escreva um e-mail para cromatografia.rbn@gmail.com que compartilho o material com você.

Boa sorte !!

Ronaldo

19 de março de 2014 05:33

 

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