HPLC na prática - parte 4: Degaseificação

 

Não há nada mais frustrante para um cromatografista do que chegar no dia seguinte em frente do seu HPLC e perceber que aquela sêquencia colocada pra rodar no dia anterior foi perdida.

Não importa se era um teste, 5 lotes de produto final, estabilidade ou uma validação de método, aquele instante da descoberta é frustrante e a única coisa que queremos saber é o que causou o problema.

Em geral procuramos por erros grandes para justificar o problema: uma coluna saturada, uma fase móvel preparada errada ou um defeito no equipamento.

Mas na maioria das vezes não encontramos o tal “problema”, e dependendo do nível de compliance da empresa em que você atua, alguns dias serão perdidos tentando justificar o erro, sem encontrar o real motivo para o problema.

O que muitos usuários de cromatografia líquida ainda não perceberam é que em geral, este “problema” grande que estamos procurando nada mais é do que a somatória de pequenos erros gerados na nossa rotina de preparação do sistema HPLC para aquela análise.

Nos próximos p

osts iremos tratar em detalhes quais são os cuidados que os cromatografistas experientes

utilizam em sua rotina para garantir uma rotina produtiva e confiável.

Degaseificação: a degaseificação é com certeza um dos pontos mais sensíveis quando tratamos de se manter uma rotina analítica eficiente e produtiva. Muitos ignoram a importância deste fator nos dias atuais, graças a grande eficiência dos degaseificadores em linha que existem hoje nos sistemas HPLC / UHPLC, mas isso não elimina o risco de problemas com bolhas.

Como funciona um degaseificador em linha: basicamente no caminho fluídico do seu HPLC há um pequeno tubo plástico permeável à gás dentro de uma pequena câmara onde é aplicado vácuo; como este tubo é bastante fino, ele apresenta uma boa área de contato e por diferença de pressão, o gás dissolvido ou pequenas bolhas são forçadas a permearem o tubo e saírem da sua fase móvel.

O que acontece quando uma bolha de ar passa pra dentro do sistema HPLC: há muitas possibilidades quando tentamos imaginar como a bolha se comporta dentro do sistema HLPLC. Bolhas grandes podem causar grande oscilação da pressão, o que em alguns sistema mais modernos causará o interropimento do fluxo; se você tiver sorte, ela pode apenas causar uma oscilação no fluxo e pressão, oque inevitavelmente causará algum efeito na cromatografia. Se esta bolha passar no sistema no momento da injeção, ela pode ocupar um determinado volume dentro do loop de amostragem, o que causará problemas de reprodutibilidade. Enquanto passa pela coluna, a bolha tende a ficar em solução, mas não elimina a possibilidade de alguma interação com a separação cromatográfica.

Mas ao sair da coluna, a pressão do sistema volta a ficar próxima a pressão ambiente e a bolha reaparece, podendo causar picos ou distúrbios de linha de base. Micro bolhas irão se apresentar como um ruído constante de linha de base, facilmente observável para quem já conhece a cromatografia daquele método / análise específica.

O oxigênio dissolvido na solução é mais grave para alguns tipos de detecção, como na fluorescência (supressão ou atenuação de alguns compostos), detectores de índice de refração ou para os detectores eletroquímicos em modo redutor.

Dicas práticas:

-    faça a degaseificação dos seus solventes para HPLC com vácuo e          ultrassom (método mais efetivo) por 10 min;

-    no caso de alta sensibilidade à presença de ar ou oxigênio dissolvido, utilize câmaras de degasser em série para aumentar a eficiência ou na purga com gás Hélio;

-    alterne o solvente utilizado nos canais do HPLC, para que ocorra um desgaste proporcional em todos

      os canais;

-    monitore a pressão do seu sistema durante os primeiros minutos de equilíbrio ou corrida, para se

      observar a presença de bolhas ou micro bolhas.

HPLC na prática - parte 3: a importância do cleanup de amostra

 

Não há nada mais frustrante para um cromatografista do que chegar no dia seguinte em frente do seu HPLC e perceber que aquela sêquencia colocada pra rodar no dia anterior foi perdida.

Não importa se era um teste, 5 lotes de produto final, estabilidade ou uma validação de método, aquele instante da descoberta é frustrante e a única coisa que queremos saber é o que causou o problema.

Em geral procuramos por erros grandes para justificar o problema: uma coluna saturada, uma fase móvel preparada errada ou um defeito no equipamento.

Mas na maioria das vezes não encontramos o tal “problema”, e dependendo do nível de compliance da empresa em que você atua, alguns dias serão perdidos tentando justificar o erro, sem encontrar o real motivo para o problema.

O que muitos usuários de cromatografia líquida ainda não perceberam é que em geral, este “problema” grande que estamos procurando nada mais é do que a somatória de pequenos erros gerados na nossa rotina de preparação do sistema HPLC para aquela análise.

Nos próximos posts iremos tratar em detalhes quais são os cuidados que os cromatografistas experientes utilizam em sua rotina para garantir uma rotina produtiva e confiável.

A importância do cleanup de amostra: John Dolan, um dos maiores especialistas em cromatografia líquida do mundo conta que quando perguntam pra ele como fazer uma coluna durar para sempre a resposta que ele dá é simples: “nunca faça uma injeção”.

É muito importante entender que o processo de cleanup de amostra é determinado no desenvolvimento do método. Para que essa etapa seja bem desenvolvida, o conhecimento da matriz da amostra é indispensável, e nem sempre isso é feito com maestria. Quanto mais limpa é sua amostra, maior será a vida útil de sua coluna e mais confiável seu método será.

Um problema conhecido de tratamento de amostra é o uso de filtro de seringa. Muito utilizado para retirar material particulado da amostra, o filtro é utilizado de maneira errônea, pois não se leva em consideração o tipo de membrana (Nylon, PTFE, PVDF, PES, CF, etc), volume de filtração, tamanho de poro, perda de volume de amostra, por exemplo. Na indústria farmacêutica, por exemplo, filtro de seringa é quase uma regra, mas qual o peso da cada filtro no custo final da injeção ? Será que não adicionei algum contaminante na análise por utilizer o filtro errado ? Será que está ocorrendo alguma retenção seletiva de um compost específico ? Será que o processo de filtração não deva ser validado para garantir e eficiência e a robustez desse método ?

Outras maneiras de tratamento de amostra devem ser considerados, como o uso de cartuchos de extração em fase sólida SPE (“limpeza química”)  e a centrifugação.

O maior problema com este material particulado entrando no sistema é o entupimento do frit de coluna. Isso leva ao rápido e prematuro aumento de pressão e perda de eficiência da coluna, gerando perdas de tempo enormes, além do aumento do custo da operação com trocas prematuras de colunas.

Outro risco é de entupimento do sistema de injeção do seu HPLC. Os principais componentes que podem entupir são a agulha, o assento de agulha e os canais da válvula de injeção.

Considere o uso de filtros de linha no sistema de injeção (normalmente com 0.5 um de malha). Este filtro irá reter o material particulado que ficaria retido na frit de 2 um da coluna e pode ser trocado muito mais facilmente que o frit da coluna.

Resumindo:

• conheça bem sua matriz para a determinação do cleanup eficiente e com o melhor custo/benefício;
• ao determinar a filtração com filtro de seringa, conheça as possibilidades e valide para um método robusto;
• pense na utilização de filtro de linha no sistema de injeção, para minimizar problemas com entupimentos de frit de colunas ou de amostradores de injeção.