Colunas de guarda realmente funcionam ??

Pergunta: Colunas de guarda realmente funcionam ou são apenas chamariz dos fabricantes de coluna ??

Resposta (John Dolan): Colunas de guarda realmente protegem as colunas analíticas de HPLC. Elas atuam de 2 formas principais. Primeiro, elas normalmente tem a mesma porosidade de frit como a coluna analitica, por exemplo, frit de 2 um e partículas de 5 um no material empacotado. Isto faz com que a coluna de guarda retenha toda e qualquer partícula que entupiria a cabeça da coluna analítica. As colunas de guarda também apresentam a mesma composição química das colunas analíticas, então qualquer coisa que possa se ligar irreversivelmente a coluna analítica ficará retida na coluna de guarda.
O truque, é claro, é substituir ou lavar a coluna de guarda antes que ela perca sua função e comece a "sangrar" para dentro da sua coluna analitica. Muitos usuários determinam a vida útil das colunas de guarda pela sua experiência e substituem estas depois de um certo n° de injeções ou determinado n° de dias.
Eu não sou um grande defensor das colunas de guarda. Sim, elas protegem a coluna analítica, mas é muito raro se conseguir um alto n° de pratos teóricos num sistema com coluna de guarda se compararmos com um sistema sem, e elas são bastante caras. A coluna de guarda ajudará a reduzir ou eliminar os resíduos de amostras sujas, mas as colunas de guarda são caras. O que realmente eu não gosto é a relação custo/benefício. Mas é difícil de argumentar em relação ao aumento da vida útil da coluna analítica. A questão é se este ganho é suficiente para justificar este incômodo para você.
Se você optar por usar coluna de guarda, adquira do mesmo fabricante da sua coluna analítica, e manter o mesmo tipo de material empacotado (C18, por exemplo). Você não quer que diferentes interações químicas ocorram na coluna de guarda e na sua coluna analítica - isto pode comprometer sua separação.

Eu preciso mesmo usar Trietilamina ?

Pergunta: Meu supervisor insiste que eu devo adicionar 20 mM de Trietilamina (TEA) em todas as minhas fase móveis para reduzir o efeito cauda., mas eu não vejo o uso de TEA na maioria dos métodos. Ele conhece algum segredo que os outros deveriam saber ?

Resposta (John Dolan): Pelo contrário, ele provavelmente está recomendando o uso de TEA porque ele trabalhou há muitos anos atrás. A função primária da TEA em métodos HPLC de fase reversa é suprimir as interações entre grupos silanóis fortemente ionizados (-Si-OH) presentes na superfície da sílica com analitos alcalinos. Os silanóis ionizados (-Si-O-) serão encharcados pelo excesso de TEA na fase móvel e não vão interagir com os compostos alcalinos e consequentemente não causarão o efeito cauda. O uso de TEA era muito comum nas colunas antigas com sílica de baixa pureza. Estas eram chamadas de Tipo-A ou sílica acidificada. Algumas marcas que podem ser familiares à você são Microbondapak, Nucleosil e Hypersil. Estas marcas de colunas eram as mais utilizadas até o meio da década de 90, mas as colunas de hoje são fabricadas com uma sílica de alta pureza (Tipo-B) que são muito menos acidificadas. Exemplos desta nova tecnologia são as colunas Symmetry, Zorbax StableBond, ACE, e Luna. TEA não é necessário para estas colunas. Eu sou um grande fiel do princípio KISS (Keep It Simple, Stupid) - quanto mais coisas você coloca na fase móvel, mais problemas está querendo arrumar.
Então, respondendo sua pergunta, o que seu chefe recomenda faz muito sentido para as colunas Tipo-A, mas não é mais necessário para as colunas com sílica de alta pureza utilizadas hoje em dia.

Volume de Pico ?? O que é ? Como calcular ??

Pergunta: O que é volume de pico e como faço para calculá-lo ?

Resposta (John Dolan): O volume de pico é simplesmente o volume de fase móvel na qual o pico elui de uma coluna de HPLC. A maneira mais simples para medir o volume de pico é medir a largura de pico, seja no monitor do computador ou em papel impresso, calculando a base do pico em centímetros. Trace uma linha reta através da base do pico, unindo a linha de base antes e depois do pico. Em seguida, trace as tangentes dos lados dos picos até a intersecção das tangentes com a linha de base traçada. A distância entre esses dois pontos de intersecção é a largura de pico, que pode ser medido em unidades de tempo. Converta o tempo para volume multiplicando a largura de pico pela taxa de fluxo. Então se a amplitude do pico é 0,345 min e o fluxo é de 2 mL/min, o volume de pico é (2 x 0,345) = 0,690 mL. Claro que seu sistema de dados já fornece a largura de pico, você pode simplesmente multiplicar este número pelo fluxo e pular a construção das tangentes.