Lavagem
A terceira prática fundamental para a operação de HPLC's com confiabilidade é mantê-lo limpo. Se você seguir o caminho através do fluxo do sistema, você notará várias áreas que podem se beneficiar de regular lavagem. Primeiro, os reservatórios de fase móvel devem ser lavados ou trocados com cada novo lote de solvente ou preparação de fase móvel. Um frasco sujo pode contaminar uma fase móvel ou solvente puro. Eu não gosto de usar tampões por mais tempo do que uma semana e solventes orgânicos por mais de um mês sem lavagem do sistema. De preferência, evite o procedimento de encher ou completar o mesmo frasco de solvente ou fase móvel, mas sim crie o hábito de trocar esse frasco toda vez que uma nova fase é preparada ou um frasco de solvente esvaziou. Na sequência vem a bomba. Eu não gosto de desligar uma bomba por mais de alguns minutos se ela contém um tampão não volátil, como o fosfato. Quando evaporar o solvente, como por exemplo ao redor do selo do pistão, material sólido se precipitará e poderá riscar os selos. Este é um dos principais motivos de desgaste prematuro de selos. Se fases móveis tamponadas são deixados no sistema por longos períodos, especialmente se for utilizada acetonitrila, eles podem formar precipitados, que podem causar desgaste de selos e travamento de check-valves. Então, lave a bomba com fase móvel não tamponada antes de desligá-la por períodos prolongados. O injetor automático também deve ser limpo com regularidade. Eu nunca vi um injetor automático que não apresentou vazamentos ou entupimentos. O solvente de lavagem do injetor automático deve ser tratado da mesma forma que a fase móvel, em termos de validade e regular lavagem ou a substituição do reservatório. Contaminantes se acumulam na coluna ao longo do tempo, muitas vezes sendo eluídos e gerando ruído em futuros cromatogramas. Este problema pode ser minimizado com a lavagem da coluna com o solvente forte da fase móvel (por exemplo, metanol ou acetonitrila), no final de cada lote de amostras ou quando a coluna é removida do sistema. Na minha experiência, é mais fácil lavarmos o sistema como indicado acima do que danificar o detector. Por esta razão, cuidar da coluna cromatográfica e manter bons procedimentos de lavagem do sistema evitam problemas de contaminação e entupimentos em células de fluxo dos detectores. Para detectores que trabalham com fase móvel no estado líquido, como os UV's e Fluorescência, somente se houver problemas específicos no detector, como bolhas, sujeira ou entupimento, siga os procedimentos indicados no manual do detector ou chame um especialista. Detectores evaporativos, como os detectores de espalhamento de luz ou detectores de massa a história é diferente. Estes detectores eventualmente criar uma película de contaminantes não volátil e requerem limpeza regularmente.
Resumo: então aí está - desgaseificar, filtrar e lavar. Agora que você recebeu todos os conhecimentos básicos necessários sobre manutenção preventiva. Evidentemente, não é tão simples, mas estas três práticas vão trazer maior confiabilidade no uso e nos resultados de cromatografia do seu laboratório. Boa sorte!
88 comentários:
olá! Faço mestrado em ciencia animal e estou pesquisando sobre hplc para determinação de aminoácidos para um seminario. sobre tecnica utilizada e reagentes, e isso tudo pra mim é mto confuso. gostaria se fosse possivel se vc poderia me ajudar. eu preciso apenas explicar a tecnia e os reagentes utilizados. Quando vi seu blog achei que vc seria a solução dos meus problemas.Obrigada!!
Olá Vani !!
Sua pergunta é bem abrangente, pois me lembro de pelo menos 4 ou 5 métodos de análise de aminoácidos. Vou tentar elaborar um texto resumido e posto aqui pra você.
Abraço.
Olá!!
Estou trabalhando com HPLC e devido a natureza de minhas amostras,creio que a coluna acabou entopindo. Estou fazendo análise de xilose, primeiramente os picos saiam bem, com o tempo foram reduzindo.
Alguma dica??
Olá Fabiana,
Me passe informações sobre sua coluna para que eu possa te ajudar com mais detalhes.
Abraço,
Olá Ronaldo!
Tenho algumas dúvidas em relação as colunas ODS(1), ODS(2) e ODS(3).
Qual a diferença entre elas?
Olá Camila,
Sua dúvida é bastante pertinente, tendo em vista que essas nomenclaturas hoje em dia são uma bagunça, mas vamos à explicação:
As colunas ODS (octadecilsilano) são as famosas C-18, escritas de maneira diferente. Alám disso, com o passar do tempo, esses recheios foram sendo melhorados e cada fabricante, visando o marketing, botou nomes e classificações para destacar sua coluna nesse monte de marcas e nomes.
Por exemplo Spherisorb e Luna são nomes diferentes para colunas com recheio de partículas esféricas. Claro que além do formato da partícula, existe mais alguns parâmetros importantes a serem levados em conmta no momento da escolha da coluna.
Quanto as ODS1, 2 e 3, se você procurar algum guia de comparação entre colunas na internet, você vai ver que elas tem diferenças entre elas, como por exemplo área de superfífie, carga de carbono (%) e pureza da sílica. As colunas Inertsil ODS, ODS2 e ODS3 são diferentes das colunas Partsil ODS, ODS2 e ODS3. Resumindo, ao mudar a marca da sua coluna numa metodologia ou testar diferentes marcas, é importante observar se as colunas apresentam características semelhantes, para que você não se assuste com resultados significativamente diferentes.
Abraço,
Ronaldo
Olá Ronaldo! Estou com um probleminha, meus picos (de qualquer amostra) estão saindo bifurcados, inicialmente achei que fosse coluna suja, fiz os procedimentos de limpeza, porém não obtive sucesso e mesmo trocando a coluna os picos continuam saindo bifurcados. Você tem alguma dica? Eu uso coluna C-18 (marca Waters spheriphorb). Outra coisa as fases móveis utilizadas basicmente são à base de metanol e ácido acético.
Aguardo resposta e parabéns pelo Blog.
Obrigado! Victor Hugo
Olá Victor,
Deixa ver se entendi seu problema: o que você chama de bifurcar é que seu pico está se dividindo, ou seja, é como seu pico tivesse dois ápices ?? Confirme essa informação para eu tentar te ajudar.
Um grande abraço,
Ronaldo
Olá Ronaldo, desculpe a demora para responder, é que estava muito ocupado.É exatamente isto, meus picos aparecem com dois ápices e as áreas se forem somadas dão praticamente a mesma obtida em experimentos anteriores.
Abraço
Olá Victor,
Vamos às possíveis soluções para seu problema:
- o frit da coluna(s) pode estar parcialmente bloqueado, e lavagens simples não resolvem o problema. É necessario inverter a coluna para fazer o back-flush. Este procedimento é feito com fluxos baixos (máx 0,2 mL/min) e preferencialmente durante uma noite (8 horas pelo menos), utilizando um solvente de lavagem (o que melhor dissolve suas amostras e solubiliza seu modificador de fase). Este tipo de entupimento pode não estar na sua coluna propriamente dita, mas na pré-coluna ou filtros em linha presentes no equipamento. Dependendo da marca do sistema HPLC, é importante saber onde estão e como trocar/limpar estes filtros em linha. É importante também salientar a filtragem de amostras em membranas 0.40 um para evitar este tipo de problema;
- a eficiência da coluna também pode ser um indicativo do problema. Injete os mesmos compostos injetados pelo fabricante no teste de eficiência do certificado da coluna, e caso o N esteja muito baixo, está na hora de trocar a coluna ou tentar regenerá-la. No caso de pré-colunas, devem ser trocadas periodicamente, dependendo do uso (máximo a cada 3 meses é um dado prático que tenho para colunas de uso rotineiro);
- o volume de amostra pode ser muito alto (conhecido como volume overload). Injete volumes menores;
- caso seu sistema use a válvula de injeção Rheodine, este problema também é característico de rotor gasto, por isso trocá-lo pode ser uma solução também. Um rotor e stator de Rheodine duram em torno de 30000 injeções;
- é importante também checar se o solvente de diluição é compatível com sua F.M. Por isso caso esteja usando algo diferente da F.M., faça um teste solubilizando sua amostra na própria composição da fase.
Lembre-se sempre que quando estamos diagnosticando um problema, nunca fazemos duas ou mais mudanças ao mesmo tempo. Sempre corrigimos algo, testamos, e caso o problema não seja solucionado, aí então partimos para a próxima mudança. O objetivo deste procedimento é adquirirmos conhecimento para cada tipo de problema, e na próxima vez que ele aparecer, saberemos o que fazer.
Um abraço e espero sua resposta com a possível solução do problema.
Boa sorte !!
Ronaldo
Olá Ronaldo, uma verdeira aula de HPLC sua resposta, me esclareceu muitas dúvidas.
Ronaldo, antes de ver sua respota, tive a intuição que poderia ser problema na pré-coluna e após limpeza da mesma com isopropanol, o problema foi resolvido.
Fui atrás de saber o que poderia ter causado este problema, fiquei sabendo, então, que nas amostras havia uma certa quantidade de glicerol. Comecei a me perguntar e passo à você a pergunta: Seria possível o glicerol, por apresentar viscosidade, estar se "agregando" ao recheio da pré-coluna e alterando os meus resultados?
A fase móvel que uso é metanol:ácido acético4% (30:70).
Outra coisa, você saberia me informar sobre algum curso de HPLC abordando a parte de manutenção e até mesmo de montagem do aparelho?
Muito obrigado novamente pela atenção e por disponibilizar um blog sobre o assunto.
Aguardo respostas
Olá Victor !!
Fico contente com a solução do problema !! Parabéns pelo resultado !!
Quanto ao glicerol, realmente ele deve atrapalhar bastante, pois sua solubilidade é bem ruim e alta viscosidade agrava o problema.
Quanto ao curso de manutenção, a Agilent tem excelentes cursos e um deles é sobre manutenção de HPLC's da marca. Claro que muitas das coisas aprendidas são aplicadas à todos os equipamentos, por isso eu indico caso você tenha interesse.
Um abraço,
Ronaldo
Olá Ronaldo!
O problema era realmente na pré-coluna. Fiz alguns testes e verifiquei que realmente era a pré-coluna que alterava os picos.
Agora peço alguma dica para "recuperá-la", já fiz algumas lavagens com isopraponol, já passei em sonificador, mas ela continua com problema. Existe algo que posso fazer ou o destino dela é o lixo?
Obrigado pela atenção e muito obrigado pelas dicas
Olá Victor,
Infelizmente as pré-colunas não apresentam a mesma qualidade de empacotamento das colunas analíticas, e a função delas é realmente "estragar" no lugar da cabeça da nossa coluna analítica. O destino dessa sua pré-coluna é o lixo mesmo.
Grande abraço,
Ronaldo
Olá Ronaldo meu nome é Tiago sou estudante de doutorado. Estou fazendo um experimento que é o seguinte: coleto o látex (subst. Leitosa de plantas), faço uma partição de hexano a n-butanol. Aí a ultima fração a aquosa, passo numa membrana de 3kDa e pego o que passa, ou seja, o que tem baixo peso molecular. Quando passo essa fração de baixo peso no HPLC, tudo sai no pico não retido, antes de começar o gradiente, ou seja, nada retém na coluna. Disseram-me que é problema na coluna, mas já usei essa coluna antes e é muito boa. Essa amostra dissolve muito bem em água, acho que ela tem uma polaridade tão alta, que possui maior afinidade pelo solvente (água) do que pela coluna C-18. Uso como solução A (água Miliq/TFA 0,1%) e solução B (ACN/TFA 0.1%). A coluna que uso é HICHROM 5 C18, BATCH NUMBER Y1102, LENGTH 25 cm, i.d 4.6mm. To pensado em fazer um teste usando Sol. A (AGUA/MEOH 10%) e sol. B (MEOH 100%), O que vc acha?abraço
Olá Tiago,
A primeira coisa é que não conheço essa membrana 3kDa, mas vamos tentar esclarecer alguns pontos:
- considerando que você tem certeza da eficiência da coluna, ficamos como problema ou sua amostra ou a fase móvel;
- como sua coluna é uma C18 (apolar) e suas amostras saem no v0, isso indica que seu gradiente tem muita água (você mnão disse qual seu gradiente mas chuto que tem muita água nesse começo) e por isso não há interação dos analitos com a fase estácionária, por consequência não temos separação;
- como dica podemos começar a fazer injeções sem gradiente, mas injeções isocráticas na proporção de 50:50 água:modificador orgânico (MeOH, ACN ou THF), e começar a mexer na mistura de acordo com os cromatogramas obtidos;
- outra curiosidade é qual a função do TFA na sua análise, pois ainda não sei que tipo de analitos você tem na sua matriz e qual o detector você está usando, importante também para podermos dar dicas mais consistentes.
Abraço e boa sorte !!
Ronaldo
o analito são peptídeos e o detector vou olhar direitinho e lhe digo...abraço
o detector é UV/visível mas to usando só o UV no comprimento de 220nm.
Ronaldo,tudo bem? muito interessante seu blog.Gostaria de saber se você pode fazer a gentileza de me enviar algum material com comparativo entre as colunas de diferentes marcas.
Trabalho com desenvolvimento de métodos e tenho tido muita dificuldade para encontrar similaridade entre algumas colunas de marcas diferentes.
Boa noite Katiane,
Segue um link bastante interessante que mostra um comparativo entre diferentes aspectos das colunas:
http://www.waters.com/waters/promotionDetail.htm?id=10048475&alias=Alias_selectivitychart__CHEMISTRY
Qualquer dúvida, fico à sua disposição.
Atenciosamente,
Ronaldo
Ronaldo,Boa Noite!
Obrigada pela dica.Muito bom o site.
Tenho um outro probleminha um pouco mais grave.Estou desenvolvendo um método para determinação de fungicidas e não encontrei muitas referencia para sua determinação com UV.Porem sei que tenho resposta do carbendazim e tiabendazol neste detector. Você possui algum conhecimento sobre o assunto? Ando tendo dificuldade com interferentes da minha matriz e os dois primeiros analitos em muitas colunas acabam coeluindo. Você poderia me ajudar? Caso tenha algum material pode me enviar no e-mail - katianebraz@hotmail.com.
Grata,
katiane
Bom Dia!
Ronaldo tudo bem?
Estou tentando encontrar referencias de validade de soluções. Nao encontrei nada em normas. Apenas a indicação de um estudo de estabilidade das mesma. Você conhece algo a respeito.
Abraços
Olá Katiane !!
Para te ajudar com mais precisão, seria necessário ver seus cromatogramas e seu método, para não irmos na direção errada.
Mas posso te adiantar que você deve conseguir separá-los fazendo um gradiente e mudando a força do seu solvente.
Me passe por e-mail as informações do seu método e uns cromatogramas para eu poder te ajudar melhor.
Abraço,
Ronaldo
Como eu poderia calcular o Ruido , existe alguma formula para isso ?
Olá docesabor !!
O cálculo do ruído é bastante simples: é o valor da intensidade de sua absorbância (a unidade depende do equipamento, podendo ser mV, AU, mAU, etc). Normalmente imprimimos a linha de base numa escala bem aproximada, para facilitar a visualização. Caso você utilize integrador, trace uma linha de base tocando o maior número de pontos da linha e no ruído mais alto, faça a medição dessa altura.
Normalmente o cálculo do ruído é muito pouco utilizado por ser um informação pobre; o que mais se utiliza é razão sinal-ruído e ruído e inclinação (signal-noise e noise and drift).
Abraço !!
Ronaldo
Olá Ronaldo. Seu blog é mesmo uma referencia muito boa e esclarece pontos importante na operação destes sistemas. Aproveito para parabenizar pelo ótimo trabalho e agradecer a ajuda que dá a todos.
Trabalho na operação de cromatógrafos líquidos para analise de toxinas naturais e estou elaborando rotinas de checagem dos equipamentos mas estou encontrando dificuldades para listar peças consumíveis que devem ser monitoradas e substituídas, assim como sua vida útil. O Sr, conhece referencias sobre estas checagens?
Muito Obrigado.
Olá Lucas,
Obrigado pela visita !!
Vamos às suas dúvidas:
- você realmente terá dificuldades em encontrar material disponível sobre quais consumíveis cada parte ou módulo do sistema deve ser trocado e qual frequência;
- quem possui tais informações são os fabricantes, mas muitas vezes nem eles mesmos sabem justificar o porque trocam determinada peça no momento da manutenção preventiva;
- podemos citar, de modo geral, as peças normalmente trocadas pelos fabricantes durante suas visitas de manutenção preventiva (MP realizada normalmente a cada 12 meses):
- bomba: selos de pistão, selos de lavagem, pistões e filtros de linha
- injetores: agulhas, selos de rotor ou de injetor, filtros de linha e seringas;
- detectores: lâmpadas.
- é importante destacar que a periodicidade destas manutenções estão relacionadas ao uso de cada cliente, por exemplo, uma universidade que usa o equipamento 2 vezes por semana não teria o mesmo desgaste de equipamento que uma farmacêutica que trabalha 3 turnos por dia;
- o grande segredo é fazer um histórico das intervenções sofridas pelo sistema cromatográfico nos últimos anos, listando todas as peças trocadas e assim, chegando numa previsão de qual frequência faremos as preventivas, ou se só trabalharemos com manutenções reativas (aquelas que esperamos o HPLC quebrar para fazermos uma manutenção)
Boa sorte e espero ter ajudado !!
Ronaldo
Olá Ronaldo!! Adorei seu blog!!
Será que vc pode me ajudar!!
Estou tentando analisar umas amostra do meu doutorado, só que estou tendo problema com a limpeza da coluna C18!
Já passei metanol, isopropanol e acetonitrila, e assim mesmo continua com a saida de alguns picos na faixa de 230, 254 e 280 nm, com pouca absorbância mas continua aparecendo.... me ajude!! obrigada
Olá Jo,
Obrigado por nos visitar !!
Sobre seu problema:
1º: saber que tipo de amostras já passaram por essa coluna facilitaria muito sua vida, pois amostras complexas e material biológico normalmente precisam de limpezas mais agressivas, atacando até o próprio recheio.
2º: uma das melhores maneiras de se lavar uma coluna é o que chamamos de back flush, ou seja, inverter o sentido da coluna e com fluxo baixo (até 0.3 ml/min normalmente) tentar retirar o que fica retido no frit, pois é muito comum o recheio estar limpo e o frit muito sujo (pressão de trabalho muito alta é um sinal deste problema). Marcas de coluna muito baratas normalmente não se pode fazer back flush, por isso, se não for marca de uma das grandes empresas do mercado, faça isso somente se você tiver uma coluna reserva.
3º: Você lavou a coluna com os modificadores corretos, mas não fez isso com o principal solvente para fase reversa: H2O. Por isso indico você fazer um gradiente, começando com 95:5 (H2O:MeOH)e ir modificando a composição a cada 10 minutos de lavagem (de 10 em 10%) até atingir 100% de orgânico. Nunca passe 100% de H2O na coluna, para evitarmos o colapso de fase.
4º: Há uma chance de você estar com seu HPLC contaminado e pensando que é a coluna, por isso indico fazer uma injeção no sistema utilizando uma conexão zdv (zero dead volume) ou união, e verificar se o pico aparece nos comprimentos de onda do seu detector DAD.
As possibilidades são inúmeras, mas creio que o começo seria nesta linha de raciocínio.
Boa sorte !!
Bom Dia,
Sou Analista de CQ, Estou com um problema com variação de pressão, não achei nenhum vazamento no sistema, qual outros fatores podem estar relacionado ao meu problema?
Olá Marcos,
Obrigado pelo seu contato conosco !!
Vamos à sua dúvida:
- para te dar uma resposta mais exata e precisa precisamos saber um pouco mais de informações sobre a oscilação de pressão: qual a pressão normal de trabalho ? Qual a pressão o sistema atinge ? Qual o tamanho da oscilação (quantos psi ou bar a pressão varia em determinado tempo) ? Sem estas informações básicas, vou te passar uma ideia geral do que pode estar causando seu problema.
- a variação de pressão pode ter diversas causas, entre elas o vazamento, mas um erro comum entre os usuários é acreditarem que verão o vazamento, e isso não procede na maioria dos casos;
- quando um vazamento é visível, ele já é um grande vazamento, mas em HPLC estamos preocupados com pequenos vazamentos, ou como chamamos de micro vazamentos;
- para um diagnóstico de vazamento, se estivermos falando de equipamentos novos, quase todas as marcas de equipamentos já possuem softwares de diagnósticos, que apresentam como opção testes como pressure test, leak test ou algo parecido;
- outra possível e bem provável causa é o travamento das check valves, que são válvulas de retenção presentes na bomba que evitam que sua FM retorne para o frasco de solvente quando o sistema está pressurizado; uma solução é a retirada destas válvulas e a sonificação com H2O e MeOH (pelo menos 15 minutos com cada solvente separadamente);
- caso haja filtros de solvente presentes dentro dos frascos de FM, eles também podem apresentar entupimento e causarem a variação de pressão;
- outro teste simples para verificar se as check valves estão parcialmente entupidas é desconectar a tubulação do sistema (normalmente na entrada da coluna é um bom ponto), aumentar o fluxo para pelo menos 2 ml/min e verificar se há a formação de um jato contínuo de FM; em caso negativo, muito provavelmente o problema são as check valves;
- sempre lembramos da importância das manutenções preventivas em equipamentos de HPLC, pois perdemos muito tempo resolvendo pequenos problemas que poderiam ser sanados na preventiva sem atrasar nossa rotina.
Boa sorte !!
Bom dia Ronaldo!
Primeiramente, obrigada por compartilhar seus conhecimentos na área de HPLC. Por mais que sejá uma técnica muito utilizada, é complicado encontrar material operacional.
Você poderia me ajudar?
Faço análise de aldeídos (formaldeído e acetaldeído) em HPLC, e gostaria de tentar melhorar a separação dos componentes e a resolução dos picos.
Opero um Agilent 1260 Infinity isocrático, tenho disponíveis duas colunas, sendo Zorbax Eclipse Plus C18 4.6X100mmX3.5u e Zorbax Eclipse XDB-C18 4.6X150mmX5u, detector a 365nm, fase móvel usual de ACN:H2O a 60:40, injetando 10uL de amostra em ACN com DNPH.
Poderia alteral o volume injetado, porém a separação fica um pouco "zoada".
Você poderia indicar a melhor composição de FM e coluna para esta aplicação?
Você tem algum blog de operação em GC?
Antecipadamente agradeço!!
Olá Alessandra,
Obrigado pelo seu contato e desculpe pela demora na resposta !!
Nunca trabalhei com análise de formaldeídos, mas numa busca rápida pela net achei um método semelhante ao seu, mas me parece que a coluna mais indicada para seu caso é uma C8. Segue link do método:
http://chromsci.oxfordjournals.org/content/46/6/461.full.pdf
Sobre cromatografia gasosa, tenho bem menos conhecimento, mas fique à vontade em perguntar.
Abraço !
Ronaldo
Boa noite Ronaldo! Primeiramente parabéns pelo seu blog, realmente muito bom. Por favor, saberia informar o que poderia ocasionar um pico de um determinado principio ativo ficar com uma área bem menor? Descartamos problemas com o padrão analítico até mesmo porque em um dia anterior, saiu tudo normal. O equipamento esta estavel e o pico esta saindo no tempo de retenção adequado. O equipamento é um Agilent Infinity 1220 (UV). Pode nos ajudar? Att.
Boa noite Carmen,
Obrigado por sua visita !!
Seu problema pode ser causado por diversos fatores, e saber exatamente o que está ocorrendo precisaria de um diagnóstico mais apurado, mas vamos aos suspeitos:
- degradação do ativo: a preparação de um padrão novo pode eliminar este suspeito;
- coluna: frits de coluna entupidos podem ser causadores deste fenômeno, mas se você tem o histórico da coluna, um aumento significativo da pressão de trabalho deveria ser observado;
- quantidade de amostra no vial: pode parecer besteira, mas alguns clientes esquecem que o injetor apresenta um limite de profundidade onde ele consegue pegar a amostra no fundo do vial, por isso é importante atenção e manter pelo menos o volume do vial pela metade (+/- 600-800 uL);
- entupimento parcial da agulha/injetor: se a área das replicatas se repetem, podemos ter algum entupimento parcial do injetor (agulha é o principal suspeito), muito comum com quem não filtra amostras ou problemas com vials, tampas e septos;
- energia de lâmpada baixa: sua lâmpada pode estar ficando velha e com baixa energia;
- célula de fluxo suja: se sua célula de fluxo do detector estiver suja, teremos perda de resposta no detector.
Há alguns outros possíveis suspeitos, mas seriam incomuns de ocorrer como placas e o próprio software.
Caso não consigam resolver, o telefone do suporte Agilent é o 0800-728-1405
Muito boa sorte !!
Ronaldo
Olá Ronaldo, meu nome é Leandro, sou da cidade de Arapongas-PR e trabalho como analista à 2 anos. Utilizo um HPLC Agilent-1100, estamos pensando em adquirir um novo equipamento e em relação à bomba, hoje utilizamos uma bomba quaternária, entre outros fatores ela é muito versátil no sentido de poder trabalhar gradientes de fluxo das FM, porém fui questionado em relação ao tipo de bomba comprar, pois uma bomba binária seria "suficiente". Você poderia esclarecer sobre algumas diferenças e aplicações práticas dos dois tipos de bombas mencionados? Obrigado.
Olá Leandro,
Obrigado pelo seu post !!
Vamos à resposta:
Tecnicamente as bombas são bastante diferentes, mas vou simplificar um pouco para não ficar muito técnico:
- a bomba binária: mistura em alta pressão, maior eficiência de mistura, delay volume menor (não confundir com volume morto), gradientes mais precisos e rápidos, com ganhos em análises onde temos separações complexas
- bomba quaternária: mistura em baixa pressão, normalmente possui algum tipo de misturador (para dar tempo de misturar seus solventes), maior delay volume, o que causa atrasos na resposta de um gradiente, dificultando separações complexas
Tirando casos de separações muito complexas, a bomba quaternária atende 99% das aplicações, com a vantagem de ser mais barata (sim, uma bomba quaternária é 1 bomba com 1 válvula misturadora, enquanto a bomba binária são 2 bombas), e a bomba binária requer mais experiência do usuário.
Indico o 1260 da Agilent, que deve atender todas às suas necessidades.
Boa sorte !!
Olá Ronaldo,
Estou tentando instalar uma coluna no HPLC porém o solvente está voltando pela conexão. Já tentamos com outras colunas e o mesmo problema continua ocorrendo. Terias alguma sugestão do que pode estar provocando este problema?
Olá Grace,
Obrigado pelo seu post e sua dúvida !!
Vamos ver se eu posso te ajudar:
- pelo que eu entendi do seu post, você está conectando uma coluna no seu sistema e o solvente vaza nesta conexão. Se realmente é este o problema, vamos à alguns possíveis problemas:
- não creio que haja um entupimento no sistema, pois nestes casos, a pressão iria estourar o limite de trabalho da bomba, e o fluxo seria interrompido;
- caso esteja utilizando conexões de aço inoxidável, a formatação deste conjunto (tubo + parafuso + anilha, dependendo da marca do equipamento a anilha não se aplica) deve estar mal feita ou defeituosa, por isso o vazamento;
- caso esteja trabalhando com tubulações em PEEK, pode ser que o aperto manual não seja suficiente para suportar a pressão gerada, e o vazamento ocorreria;
- uma fissura na tubulação também pode ser o problema, e uma microfissura nem sempre é possível ser visualizada.
Outras dezenas de problemas são possíveis, mas eu precisaria de mais informações para te ajudar.
Fique com meu e-mail para uma ajuda mais rápida: ronaldo@chromaservice.com.br
Boa sorte !!
Bom dia!
Parabéns pelo seu blog!
Utilizamos um UHPLC e estamos com um problema de agulha do amostrador automático que entope...
Usamos muitos tampões e acetonitrila em nossas fases...
terias uma sugestão de solução de limpeza que ajudasse evitar esses entupimentos?
Poderíamos deixar a agulha em ácido nítrico a 1% no ultrassom?
atenciosamente
Olá Ana Cristina !!
Obrigado por nos visitar !!
Vamos à sua dúvida:
- o sistema UHPLC (não sei quem é o fabricante, mas isso é uma regra) possui filtros em linha no caminho fluídico para evitar estes entupimentos; normalmente bombas e injetores possuem pequenos filtros (micragem pode variar) que seguram partículas sólidas vindas da F.M., amostras e possíveis precipitações; não é comum a precipitação de tampão na agulha (conheço bem os UHPLC`s Waters e Agilent, pode ser que outras marcas tenham algum problema diferente), pois precipitações seguem algumas regras para ocorrer;
- minha suspeita número 1 é a falta de filtração de amostras; na sequência de suspeitos, a falta de manutenção preventiva com troca da agulha, pois as soluções ácidas atacam o aço e corroem o interior de tubulações e agulhas, o que favorece o entupimento, outro suspeito é a solução de lavagem da agulha (isso é mais ou menos importante, dependo do faricante do UHPLC), pois o tipo de injetor pode propiciar que soluções ácidas ou tampões fiquem parados no sistema de injeção; água com 5% de orgânico é a solução ideal para análises com muito tampão.;
- a limpeza com ácido nítrico pode sim ser feita, mas é um paleativo, pois como eu disse acima, ácidos atacam o aço, e com o tempo cria pequenas fissuras no interior da agulha, que propicia o acúmulo de sais e posterior entupimento.
Boa sorte e fico à disposição !!
Bom dia.
Tenho um HPLC Waters 2695 alliance e estou com seguinte problema.
O equipamento desliga e reinicia do nada. Acerto ele e coloco minhas amostras para rodar e do nada ele desliga. O que você imagina que seja?
OBS: Ele esta com o teclado apresentando problemas. Algumas teclas não funcionam.(já comprei o teclado e estou apenas esperando o técnico para fazer a troca).
Acha que pode estar fechando algum tipo de curto e por isso ele desliga sozinho?
Olá Jhonny,
Obrigado por nos visitar !!
Seu problema está ligado à algumas causas possíveis, como problemas com rede elétrica, problemas com placas eletrônicas, mal contato e curtos-circuitos.
É claro que só um técnico no local para te dar o diagnóstico correto.
Só um alerta: tenha certeza de que quem avaliará seu problema tenha o conhecimento da máquina, pois problemas como o seu variam de um pequeno problema de alimentação elétrica ou uma bateria de placa principal com baixa voltagem até realmente um problema com uma placa danificada. Essa diferença de conhecimento pode fazer o atendimento variar entre algumas centenas de reais para alguns milhares.
Boa sorte !!
Boa tarde,
Gostaria de parabeniza-lo pelo seu blog, tem me ajudado bastante.
Estou fazendo mestrado e utilizando um HPLC da Thermo. Já tive alguns probleminha com ele, mas até mês passado conseguia reproduzir os cromatogramas sem problemas. Como estava querendo melhorar a resolução dos picos, fiz uma limpeza com ACN por umas 2h e tentei reinjetar (recomendação de um professor que trabalha com HPLC). Depois dessa limpeza da coluna não consegui mais obter picos sem uma cauda gigante, fora que os tempos de retenção estão variando um pouco, cerca de 0,2 s. Essa limpeza feita poderia ter afetado a coluna?
Uso como faze móvel tampão fosfato pH3 e ACN (77:23), modo gradiente até 10:90 em 6 min.
Obrigada pela atenção
Olá Ana Caroline,
Obrigado por nos visitar !!
Vamos tentar te ajudar: é muito comum encontrarmos como conceito de limpeza de coluna o uso de um modificador orgânico (estou deduzindo que sua coluna é de fase reversa, provavelmente uma C18), comumente ACN ou MeOH para limpar a coluna, mas é um grande erro, principalmente em casos como o seu. Com sua coluna contendo grande quantidade de tampão (não sei qual concentração, mas qualquer coisa acima de 100 mMol é uma grandeza de problemas), ao você "lavar" com 100% de ACN, há uma grande chance de você ter precipitado tampão em sua coluna. Para tentarmos resolver seu problema, uma lavagem em backflush é a indicação, mas o problema é um pouco mais embaixo, pois, dependendo da marca da coluna, uma lavagem como essa pode decretar o fim de vida útil dela. Para eu não me alongar sem ter certeza do que fazer, seria interessante você me passar a marca da sua coluna, e no próximo post me alongo explicando pra você o que podemos fazer em seguida.
Boa sorte !
Bom dia!
Estou tentando identificar um peptideo, o Dotatate(octreotate) no HPLC mas não estou conseguindo obter nenhum sinal. Acho que mesmo se esse peptideo estivesse degradado algum sinal deveria aparecer. Preciso urgentemente de sua ajuda. Estou usando fase movel acetonitrila e agua e uma coluna C18 de 5 micra.
Boa Noite,
Se fosse possível gostaria que me explicasse como calculamos o tempo de lavagem de uma coluna,sei que é pelo seu volume, mas não está muito claro para mim. Poderia me explicar por gentileza!
Grata
Olá Marcilene,
Obrigado por visitar o blog !!
Apesar do seu questionamento trazer pouquíssimas informações, eu procurei na internet algo sobre a molécula e não encontrei grande coisa, somente que é um radioquímico, e alguns métodos que encontrei utilizam detectores de contagem radioativa.
Peço desculpas mas com tão pouca informação não posso te ajudar.
Estou à disposição caso necessite de mais ajuda.
Boa sorte !!
Olá Evelin !!
Se convencionou utilizar entre 10 e 20 volumes da coluna como o tempo aceitável para uma boa lavagem da coluna.
Você pode utilizar este link para o cálculo, se quiser:
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/CategoryDisplay?categoryId=3292438&catalogId=122133&productId=&top=Y&storeId=11755&langId=-1
Ou pode digitar HPLC column volume calculator que este link e outros devem aparecer como opção pra você.
Vou pegar como exemplo uma columa com 100 mm de comprimento e 4.6 mm de largura, e tendo um volume aproximado de 1.66 mL. Multiplicando por 20 veses, temos por volta de 33 mL, e se utilizarmos o fluxo mais comum em HPLC (1 mL/min), teremos que lavar nossa coluna por volta de 30 min.
Eu prefiro outra abordagem, um pouco mais técnica, que é o desenvolvimento da lavagem da coluna durante o desenvolvimento de metodologia, pois para algumas análises simples, onde a matriz é bastante limpa, 10 ou 15 minutos de uma lavagem bem feita é suficiente, e ao mesmo tempo, quando temos matrizes complexas ou métodos mais elaborados, podemos ter lavagens de até 2 horas, para garantirmos que a coluna estará sempre limpa para o próximo uso.
Boa sorte !!
Olá Carla !!
Obrigado por nos visitar !!
Vamos à sua questão:
- o injetor manual Rheodyne é reconhecidamente um injetor muito durável e confiável, mas apesar de simples, ele necessita de cuidados básicos;
- o travamento do seu injetor pode ter algumas causas, como o acúmulo de pó / sujeira no mecanismo de injeção (mudança de posição entre load e inject), desgaste ou quebra de algum dos componentes internos do injetor, comumente o selo do rotor ou o stator face (em Português não temos boas palavras pra isso, mas basicamente é a peça principal do injetor onde os orifícios dos canais se encontram)
- uma lubrificação pode ser feita com o objetivo de desemperrar o injetor, mas uma limpeza com solvente das partes contaminadas com o lubrificante / desengripante deverá ser realizada;
- a troca do selo do rotor normalmente é feita a cada 30 ou 40 mil injeções (se bem cuidado, pode durar muito mais);
- uma prática interessante é sempre após o uso limpar a válvula, injetando solvente nas 2 posições (load e inject)
- mão de obra especializada pode ser necessária para usuários sem experiência em manutenção.
Muito boa sorte !!
Bom Dia,
Gostaria de saber porque é recomendado, usar liquido de lavagem Acetonitrila, para análises de hormônios.?
Obrigada!
Olá Evelin,
Obrigado por nos visitar !!
Seu questionamento é interessante, mas para eu poder te dar uma resposta mais precisa, eu precisaria ter certeza de que você está falando da solução de lavagem do injetor.
Mas posso pontuar algumas informações importantes:
- Como temos diversas marcas, modelos e gerações de equipamentos, temos que ter muito cuidado em não generalizar as informações, pois a engenharia de cada fabricante pode exigir detalhes como este comentado por você;
- Atualmente, as principais marcas apresentam equipamentos com 2 lavagens básicas: lavagem de selos da bomba e lavagem de agulha do injetor; devido aos detalhes que mencionei no item acima, variantes destas lavagens existem, com solvente fraco e forte de lavagem, ou lavagem interna / externa da agulha, etc, etc;
- lavagem de selos são essencialmente lavagens feitas com água (a solução normalmente apresenta 10% de orgânico na composição, para evitar fungos);
- lavagem de agulha deve ser determinada no desenvolvimento do método, mas em geral, o solvente da sua amostra é a lavagem ideal (exceto solução de pH`s extremos e tampões, onde estes são substituídos por solução água: orgânico 90:10)
- Acetonitrila é um solvente que por prática, eu evito deixar no sistema (prefiro o metanol), por 2 motivos: solvente caro e um dos seus resíduos de obtenção tem como característica grudar nas checkvalves da bomba;
- no seu caso, por se tratar de uma nálise específica de hormônios, provavelmente alguém já tomou o cuidado de determinar a acetonitrila como melhor solução de lavagem pois deve ter idenficicado problemas com outros solventes.
Um grande abraço !!
Ronaldo excelente o seu trabalho.
Desculpe a inconveniência mas sei que se trata de hplc entretanto minha duvida é de CG.
Recentemente meu padrão interno iso_octano solubilizado em toluol está apresentando um problema de separacao que não acontecia antes. O histórico do equipamento conta com os mesmos produtos que sempre analisamos embora tenha surgido um novo que é muito visccoso em temperatura ambiente porem no preparo para injeção o mesmo se torna solução nao viscosa. Acontece que as amostras que fazem uso do tolueno e daquele padrao interno ja foram analisadas sucessivas vezes após produto novo. Em coluna db5 de 60 m.
Agora meu padrao interno apresenta pico deformado, quase que 2 sonais num só, já fiz teste de checagem dos solventes e troquei os lotes dos mesmos. Fizemos limpeza no split e rampa na coluna e mesmo assim persiste. Gostaria de ter certeza que o produto novo não é o causador. Para se ter uma ideia nao há sangria e a analise apenas do solvente toluol não gera sinal na região do pi.
Como posso limpar a coluna de cg ou proceder para eliminar o pico problema?
Olá Flávio,
Obrigado por nos visitar !!
Realmente meu conhecimento em GC é infinitamente inferior à LC, mas tem alguns anos que dou manutenção nestas máquinas, e posso tentar te ajudar.
Vamos lá:
- pelo que entendi, seu pico está dividindo;
- como não sei qual o tipo do seu inlet, vou te guiar em linhas gerais e no S/SL (split/splitless), que é o inlet mais comum;
- inlet muito quente;
- inlet sujo (liner, selo de ouro, etc);
- contato da amostra com metal;
- compostos muito lábeis;
- coluna ativada, ou seja, muto velha e quase sem recheio, que já perdeu sua camada de inertização;
- liner ativo (velho, sujo ou que foi muito lavado/limpo), ou seja, não está mais inerte;
- tempo de residência muito longo (aumentar fluxo de split e/ou fluxo da coluna);
- incompatibilidade entre solvente e coluna (comum em splitless ou ptv);
- pobre técnica de injeção (quando falamos de injeção manual ou um injetor autolático com defeito);
- coluna mal instalada no inlet;
- variaçÕes de temperatura no forno (não esperadas / não programadas);
- coeluição de compostos (amostra contaminada ou inlet contaminado);
Boa sorte !!
Olá Ronaldo....
Preciso de uma ajuda....
Tenho um HPLC Agilent Infinity LC com detetor DAD e estou com problemas de repetibilidade nas injeções. De quatro injeções que são feitas, a primeira sai igual a terceira enquanto a segunda sai igual a quarta. Tem ideia do que pode estar acontecendo? Quais os procedimentos que devo tomar? Agradeço desde já. Débora
Boa noite, parabéns pelo trabalho.
Estou desenvolvendo um método de doseamento de ativo. O ativo é um quelante similar ao EDTA bem polar, com pka de 1,8. Estou usando uma coluna Nucleodur (C18 com endcapes OH) e fase móvel 10:90 ACN:água. Ja testei várias mudanças e essa é a melhor, mas mesmo assim, o pico está saindo entre 3 e 4 e no produto final sai quase junto com excipiente. Tens alguma sugestão para me dar?
Meu e-mail: fe_gobbi@hotmail.com
Obrigada
Boa noite Debora,
Mil perdões na demora da resposta, mas seu post caiu na minha caixa de spams.
Vamos lá ao seu problema:
- curioso o fato de que as injeções saem similares entre injeções pares e ímpares !
- você não detalhou se seu problema é repetibilidade de área ou tempo de retenção, mas desconfio que estamos falando de área;
- problemas de variação de área estão quase sempre ligados à problemas no injetor, mais precisamente com vazamentos, mas o fato das injeções darem o mesmo valor intercalado, leva à suspeitas de problemas dos mais variados, desde o próprio injetor (possivelmente não vazamento), detector, e outros fatores externos, como rede elétrica;
- caso você tenha conhecimento / treinamento de manutenção básica, é possível avançar um pouco mais no diagnóstico,mas em caso negativo, somente um técnico Agilent habilitado poderá te ajudar.
Muito boa sorte !
Boa noite Fernanda,
Quelantes são bastante chatos de trabalhar, e eu acabei trabalhando muito pouco com este tipo de análise.
Consegui algumas informações pesquisando na net, e veja se podem te ajudar:
- a técnica de pareamento iônico é a mais utilizada nestes casos, e é necessário a formação de complexos metálicos, normalmente com Fe3+ ou Cu2+, que melhoram a sensibilidade de detecção em detectores UV-Vis;
- dá uma olhadinha no link abaixo. Creio que possa te direcionar:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095177916300028
Muito boa sorte e qualquer coisa escreva !!
Boa tarde,
Trabalho com proteínas da clara de ovo e utilizo uma coluna C18. Hoje, quando fui analisar minhas amostras, no momento em que a mesma é injetada, uma das bombas chega à pressão máxima e o equipamento desliga. Estou passando acetonitrila constantemente, porém, sem sucesso. Voc~e poderia, por favor, me auxiliar?
Obrigada
Boa noite Ronaldo!
Mto obrigado pelo conhecimento compartilhado!
Trabalho com protetores solares, realizando o doseamento dos filtro por CLAE, utilizo na minha fase móvel água:Acetonitrila 20:80 coluna C18, meus filtros são uvinul A, octocrileno, parametoxicinamato, tinossorb entre outros.
Meu método sempre deu certo, mas de uns dias pra cá, meus filtros não estão saindo todos no cromatograma, onde deveriam ter 5, só estão saindo 3. O que pode estar acontecendo? Minha coluna é nova tbm.
Boa noite Sara,
Obrigado por nos visitar !
Eu adoro o blog porque sempre estou aprendendo um pouco, principalmente em saber como a cromatografia é abrangente e sua capacidade de separar coisas que eu nem faço ideia !!
Seu problema é bastante abrangente e as variáveis são muitas, mas vamos aos principais suspeitos:
- os principais responsáveis pela separação são FM e FE (coluna), e se você não está vendo o que sempre viu, estes são seus maiores suspeitos. Confira composição de sua fase móvel e se vc não mudou algo no caminho (exemplo: THF pode ser estabilizado por mais de um estabilizante, e dependendo da metodologia, isso é o fiel da balança estre ver seus analitos ou não. A coluna por ser nova é menos suspeita, mas se tiver outra é sempre bom testar, pois não seria a primeira vez que eu veria uma coluna nova não estar com boa resolução (pratos teóricos baixos).
- seu equipamento também pode ser o causador do problema, pois uma lâmpada com número de horas excessiva, um injetor ou bomba vazando podem ser o culpado pelo ocorrido.
- a dica mais importante: comece pelo mais óbvio, seja detalhista e analise criteriosamente seus procedimentos, métodos, setup de instrumento, etc.
Se precisar de mais ajuda, estou por aqui !!
Abraço,
Boa noite Debora !!
Desculpe minha falha, mas respondi sua dúvida e não sei o que ocorreu ela ficou no google parada, esperando postagem.
Segue minha resposta atrasada:
Sua matriz é bastante pesada (proteínas) e costuma dar trabalho em qualquer falta de atenção nos cuidados com o sistema e coluna. Se sua bomba está estourando pressão,com certeza temos um entupimento, e o local mais suspeito é a coluna.
Sempre que for investigar / diagnosticar um entupimento, alguns cuidados são necessários.
1- Sempre aumentar a pressão aos poucos, de 0.1 ml/min em 0.1 ml/min, sempre para não danificarmos coluna e ou sistema.
2- Desconecte seu detector como segurança; se ao começar a subir o fluxo a pressão estiver normal, possivelmente temos uma cela de fluxo entupida, e estas normalmente não suportam pressão superior a 1000 psi ou 70 bar; se isso ocorreu, a melhor maneira de desentupir é invertendo o fluxo na cela (conecte seu fluxo na saída da cela e a entrada direcione para um descarte), subindo o fluxo lentamente e verificando se a pressão baixa, o que mostra o desentupimento. Se sua FM tinha sal, água quente (40-60C) pode ajudar no processo.
3- Caso o entupimento não esteja na cela de fluxo, vá soltando tubulações de trás pra frente, ou seja, após a cela, solto a tubulação do forno de colunas e testo em seguida; depois desconeto a tubulação do injetor e testo, e assim até chegar na saída da bomba.
4- Se o entupimento estiver na sua coluna, aí temos um problema mais complexo, e eu precisaria de alguns posts para responder. Dê uma olha nos posts que já temos que eles podem te ajudar.
Abraço,
Prezado Ronaldo. Boa noite. Desculpe a imensa demora mas a resolução foi fruto de descontaminação de alguns materiais e todas as suas dicas ajudaram. Obrigado.
Olá Flávio !!
Fico contente em ter ajudado e estamos à disposição.
Abraço
Boa Tarde Ronaldo!
Comecei a trabalhar agora no HPLC, sou Doutoranda, aqui não temos técnicos e estou com algumas dúvidas básicas como por exemplo: Nosso injetor é manual, eu preciso limpar o injetor (local em que acoplo a seringa) ou na limpeza da coluna que faço com a acetonitrila ela passa por lá? Me tira essa dúvida por favor. Eu posso injetar solvente na posição load para este lavar esse sistema e cair no loop ou ele sempre vai cair na coluna?
Grata,
Olá Rayssa,
Sempre é importante limpar seu injetor manual, e a solução mais indicada é o diluente de sua amostra, sempre lembrando que caso você use tampão ou pH neste diluente, substitua por água. Na posição inject, vc não estará limpando o loop, por isso é importante também chavear o injetor para a posição load e lavar seu loop. Evite manter a coluna neste momento, e utilize um conetor zvd (zero dead volume), ou um capilar.
Boa sorte !
Olá Ronaldo, Excelentes Blogs, parabéns!
Deixa eu fazer uma pergunta. Estou limpando uma coluna (ZORBAX SB-C18, 5um), estou USANDO H2O, metanol e ACN, mas quando coloco H2O:metanol (~50:50) a pressão aumenta demais passando o limite da coluna e parando o processo ( Não acontece isso com os outros sistemas eluentes). O que pode estar acontecendo? alguma ideia.
Obrigado desde já
Olá !!
Desculpe mas não tenho seu nome, por isso o cumprimento básico !!
Vamos lá quanto à sua dúvida: um dos termos da equação de cálculo do famoso back pressure é a viscosidade, e seu exemplo é o mais comum caso onde os usuários não entendem por que a pressão durante um gradiente sobe demais e por vezes até desliga a bomba devido ao excesso de pressão, o que ocorre é que a viscosidade desta mistura é mais alta exatamente perto de 50:50 (mais exatamente 45:55 H2O:MeOH), e com o aumento da viscosidade o aumento de pressão é diretamente proporcional. Se você um dia já trabalhou com esta metodologia com esta composição de FM e funcionava, provavelmente sua coluna tem frits entupidos ou está muito suja. Faça um gradiente de FM inicialmente ignorando o meio de composição, ou seja, suba de 10 em 10% até 30:70 MeOH:H2O e pule para 70:30, nunca passando 100% de água numa coluna de fase reversa tradicional com base de sílica. Em seguida, faça a lavagem no 50:50, mas limite o fluxo para evitar o excesso de pressão dentro da sua coluna (vá até 70-80% do limite de pressão indicado no manual da coluna). Dessa maneira, você deve conseguir limpar um pouco mais, e caso contrário, somente a regeneração pode resolver.
Boa sorte !!
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