Os 10 maiores mitos sobre colunas de HPLC - Parte 1

Mito 1:



"Você não pode inverter uma coluna HPLC"



Falso. Na prática, uma coluna de HPLC é empacotada com pressões muito mais elevadas que sua pressão máxima de trabalho. Assim, se o solvente adequado foi utilizado para estabilizar o leito empacatado, uma coluna bem empacotada deve ser capaz de trabalhar em ambos os sentidos. Algumas das razões do por que iríamos querer inverter o sentido do fluxo de uma coluna cromatográfica são as operações de lavagem de coluna com fluxo invertido, retirando amostras fortemente adsorvidas na sua entrada (um percurso mais curto do que empurrar os materiais insolúveis e tentar passá-los por todo o comprimento da coluna), e retirar partículas presas para diminuir a pressão de trabalho.

Há uma exceção para inverter o fluxo de uma coluna HPLC. Se o fabricante da coluna utilizou um frit de porosidade maior na entrada da coluna, a inversão da coluna poderá arrastar partículas do leito empacotado para fora da coluna. Quando a coluna é empacotada em uma fábrica, a porosidade dos frits nas saídas da coluna devem ser menor do que o menor tamanho de partícula da coluna. Por exemplo, se a coluna empacotada tem um diâmetro médio de 5 μm e uma distribuição de tamanho de partículas de 3-7 μm, o frit utilizado nas saídas da coluna devem ser inferior a 3 μm para evitar que partículas irão escapar do leito empacotado durante o uso da coluna. Para esse exemplo, a maioria dos fabricantes utilizam um frit de 2 μm.

Por que um fabricante tem diferentes porosidades de frits na entrada e saída da coluna ? Simples. Um frit de maior porosidade tem menor tendência de entupir do que um frit de menor porosidade. Um frit de 0,5 μm vai entupir mais rápido do que um frit de 2 μm. Então, para impedir o rápido aumento de pressão e de reclamações de clientes, o fabricante utiliza um frit de maior porosidade na entrada da coluna. Normalmente, a coluna é marcada com uma seta que indica que ela deve ser utilizada em uma só direção. Antes de inverter uma coluna HPLC, o melhor é consultar as instruções de utilização da coluna ou verifique com o fabricante coluna para ver se a coluna pode ser invertida.



Mito 2:



"Todas as colunas C18 (L1) são iguais"



Falso. No início da técnica de HPLC, octadecilsilano (mais frequentemente referida como um ODS ou C18) foi uma das primeiras fases estacionárias ligada que se tornaram disponíveis para a nova técnica chamada "cromatografia de fase reversa". Ele se tornou a fase estacionária padrão para a cromatografia de fase reversa, e foi rapidamente adotada pela maioria dos praticantes. Como a indústria farmacêutica foi um dos primeiros setores ao utilizar HPLC e os órgãos reguladores não queriam indicar um determinado fabricante de coluna, o FDA e a USP desenvolveram um sistema de classificação que deu um designação genérica para cada novo método que foi apresentado no âmbito de uma nova aplicação de uma droga. Para as colunas HPLC, uma denominação "L" foi dada e a fase estacionária C18 foi utilizada na maioria dos métodos testados, tornando-se "L1". Como fases diferentes foram adicionados, elas receberam seu próprio "L" seguido de um número (por exemplo, L7 - C8, L10 - CN, L11 - Fenil e assim por diante).

Infelizmente, este sistema de designação revelou-se pouco confiável, pois cada marca de coluna C18 foi sintetizada diferentemente, usando sílica gel como material base e resultando em colunas de fase reversa com propriedades diferentes. Para exemplo, alguns fabricantes utilizam octadecilmonoclorosilano e uma sílica gel de baixa superfície, enquanto outros utilizaram o mesmo silano, mas ele ligado a uma silica gel de maior superfície. Estas duas colunas C18 teriam comportamento diferente, com esta última tendo mais C18 do que a primeira. Uma baixa cobertura da fase ligada, deixa silanóis que não reagiram e causam mecanismos de retenção variados. Alguns fabricantes utilizam di e triclorosilanos na polimerização para formar uma camada mais espessa, com diferentes propriedades de difusão. Para reduzir a quantidade de silanóis que não reagiram e estabilizar a fase ligada, alguns fabricantes cobrem estes silanóis com um pequeno silanol (por exemplo, trimetilmonoclorosilano). Silanóis às vezes são responsáveis pela cauda nos compostos básicos em faixas de pH intermediários. Alguns fabricantes vão ainda mais longe e aplicam uma segunda camada de um pequeno silanol para proporcionar uma superfície ainda mais inerte. Alguns fabricantes estão utilizando polímeros como material de suporte (substituindo a silica) e em seguida ligando moléculas de C18 à sua superfície, resultando em uma C18 com empacotamento totalmente diferente, mas ainda assim sendo considerada uma "L1". Outros usam organoalcoxisilanos que possuem um grau diferente de reatividade e podem produzir uma C18 de fase ligada ligeiramente diferente do que seria com um reagente organoclorosilado.
Portanto, a declaração de que "uma C18 não é igual a outra C18" é válido ainda hoje. Todas as fases C18 não são iguais e o usuário deve ter certeza que uma vez que um método é desenvolvido, ele indique o P/N da coluna para se garantir um método consistente e robusto. Nos últimos tempos, especialistas têm estudado um grande número de fases C18, numa tentativa de determinar que tenham as mesmas características de tempo de retenção e seletividade. Pela caracterização das fases baseadas em pelo menos cinco parâmetros de retenção, eles têm classificado fases com um valor numérico para que um possa ser capaz de escolher a fase mais similar em características de performance no caso da fase C18 de um determinado fabricante não estar disponível para uso. Esse levantamento também pode encontrar uma fase C18 totalmente diferentes das atuais, podendo abrir o leque de opções de fase C18 para o desenvolvimento de novos métodos.

fonte: http://www.lcgceurope.com