domingo, 26 de outubro de 2008

Cromatografia de Troca Iônica - Parte 1

Atendendo às solicitações de um dos participantes do blog, vamos falar um pouco sobre cromatografia de troca iônica. Não tenho qualquer experiência nessa técnica, pois atualmente ela é pouco usada em HPLC. Consultei alguns materiais para elaboração deste post, e quaisquer outras informações adicionais serão bem-vindas.



A cromatografia de troca iônica, foi desenvolvida em meados dos anos 1970, quando foi mostrado que misturas de cátions e ânions podem ser facilmente resolvidas em colunas de HPLC com resinas trocadoras de cátions e ânions como fases estacionárias. É usada para a separação de compostos iônicos ou ionizáveis. O princípio de separação é uma troca de íons do analito com os íons fixados no trocador de íons. A técnica tem sido utilizada há muito tempo, e algumas técnicas analíticas específicas baseadas na troca iônica podem ser vistas como antecessoras da cromatografia líquida de alta eficiência. Um exemplo específico é a análise de aminoácidos, que combina a separação por troca iônica de alta eficiência com a derivatização com ninidrina, sendo uma técnica altamente sensível e seletiva.

Atualmente, a troca iônica raramente é utilizada em HPLC, que é dominado pela cromatografia de fase reversa. Contudo, a técnica de troca iônica se mostra inigualável na separação de biomoléculas, especificamente proteínas e ácidos nucleicos. Também é ainda muito utilizada na análise de íons inorgânicos. A técnica específica utilizada para a análise de íons inorgânicos é chamada de cromatografia iônica.

Mecanismo de retenção

Trocadores Iônicos são preparados anexando cátions ou ânions à uma matriz de suporte. Para satisfazer a necessidade pela eletroneutralidade, os íons fixados são associados com íons de cargas opostas. Estes íons são móveis e podem ser trocados por outros íons de mesma carga, incluindo os íons do analito. Íons diferentes possuem afinidades diferentes daqueles dos íons fixos, que pode ser expressa como uma constante de equilíbrio de troca iônica. As diferentes afinidades são a base da separação por troca iônica. Quando analitos com diferentes afinidades daquela das resinas dos trocadores iônicos são injetadas dentro de uma coluna de troca iônica, aquelas com maior afinidade com as cargas fixadas migrarão através da coluna mais lentamente. A retenção é reduzida aumentando a concentração dos íons competidores na fase móvel. A retenção e a seletividade da separação podem ser influenciadas pelo tipo de íon competidor e sua carga, e/ou pela mudança de carga dos íons do analito, or exemplo, por uma alteração do pH ou uma complexação.
A troca iônica pode ser aplicada para a separação de íons orgânicos e inorgânicos, e também de biomoléculas como aminoácidos, peptídeos, proteínas, ou ácidos nucleicos.

fonte: livro HPLC Columns - Theory, Technology, and Practice Autor: Ewe D. Neue

10 comentários:

Ricardo de Santis disse...

Parabens pela iniciativa!
Precisamos de pessoas como você, sem medo de dividir seus conhecimentos e sempre disposto a aprender mais.

Muito sucesso e abraços

Ricardo de Santis junior

Ronaldo Buissa Netto disse...

Elogio de amigo não vale !! Fala aí Ricardão !! Grande abraço e se precisar estamos aí !!

Unknown disse...

A explicação deve ser ótima mesmo para quem está familiarizado com isso tudo, li, reeli e até agora não entendi e a tal de cromatografia de filtração molecular e eletroforese, que diabos é isto???? socorrooooooo...é bonito, mas difícil demais de compreender.
Abraços.
Parabéns, sucesso na sua vida e sua carreira.

Patrícia Bernardino

Ronaldo Buissa Netto disse...

Olá Patrícia !

Desculpe o texto técnico, mas infelizmente esse material em que me guiei não era realmente o mais simples que já vi...Como comentei no início do texto, a troca iônica não é meu forte, mas vou em busca de um material mais fácil de entender e postarei aqui pra você.

Abraço,

Ronaldo

Anônimo disse...

Olá, muito bom seu post! Cromatografia de troca iônica não é lá uma das coisas mais fáceis mesmo, tá de parabéns! Compartilhar sabedoria é o que há!
Abraços!

ps: se quiser ajude com o próximo post, pode me contatar, eu estou me aventurando por cromatografia também, principalmente o de troca reversa

Ronaldo Buissa Netto disse...

Olá Dieguito !!

Se tiver material pronto na área de cromatografia, me passe por e-mail que posto aqui no nosso blog, é claro com seus créditos, pois a idéia aqui é essa: formarmos um grupo de discussão e conhecimento na técnica.

Grande abraço,

Ronaldo

Odirlei disse...

Boa Tarde,

Parabéns, excelente conteúdo, respostas claras e objetivas.

Ronaldo estou iniciando na área de Análises Clínicas e vou trabalhar com HPLC, gostaria se possível de um e-mail para contato, pois acredito que você possa me ajudar muito com algumas técnicas.

Muito Grato,

Um abraço.

Ronaldo Buissa Netto disse...

Olá Odirlei,

Fique à vontade em me escrever no cromatografia.rbn@gmail.com, mas se não tiver problemas em postar aqui no blog, é mais interessante pois podemos ajudar mais pessoas com sua dúvida.

Abraço,

Ronaldo

Fábio Moura disse...

Olá Ronaldo,
gostaria de tirar um dúvida com vc...:
Trabalho com LC Agilent a +/- uns 6 anos e, nesses ultimos tempos tenho precisado tirar umas quantificação no modo Normalização (Norm%).

O meu analito é uma proteína (rHu G-CSF). Para esta análise é preparado uma Solução Referência "a" (SR-a) 0,3mg/mL e, apartir desta prepara-se a SR-b que é submetida a um processo de Oxidação em H2O2 0,45% a fim de se formar G-CSF Oxidado 1 e 2. O volume de inj. é o mesmo p/ ambas amostras... Na SR-a é obtida a área da Referência íntegra, na SR-b a área de G-CSF diminui em função da oxidação da mesma e dando origem ao Oxidado 1 e 2.
Eu tenho integrado a SR-b normalmente e imprimo um "Report" em "Area%" e a % de cada pico tenho utilizado na tabela de calibração, porém, agora no modo "Norm%" do "´Specif Report"...

Se porventura aparecer um Oxidado na amostra, a área da mesma é divida pela área do correspondente Oxidado na SR-b e multiplicado pela % calibrada.

Dúvida:
- Esse processo q tenho feito está correto???
- Uma vez a somatória dos picos calibrados sempre serão 100% no modo Norm%, se por acaso aparecer uma impureza qqr q não seja um oxidado 1 ou 2, como q irei quantificá-la???

Muito obg pela atenção e me desculpe se fui muito extenso.

Fábio Moura
E-mail: fabiomoura.pharma@gmail.com

Ronaldo Buissa Netto disse...

Boa tarde Fábio,

Não sei se entendi bem sua dúvida, mas vamos às respostas:

a normalização de área, é uma maneira bem simples de cálculo, que reporta a área de cada pico no cromatograma como uma % da somatória de todas as áreas.

Normalização não necessita de calibração.

Como restrição, posso cita que o método assume que o detector responde igualmente à todos os analitos; assume que todos os componentes de amostra estão sendo vistos no cromatograma; e picos estranhos podem interfirir na quantificação.

Nunca utilizei a normalização de área, mas é bem simples saber se o cálculo está certo: utilize uma injeção simples de padrão e faça o cálculo proposto por você. Digo isso por não lembro de colocar amount (quantidade) no padrão quando usando normalização, por isso não tenho certeza que funcione.

Vou tentar essa semana fazer alguns testes com normalização e posto para você.

Boa sorte !!

Ronaldo