Atendendo às solicitações de um dos participantes do blog, vamos falar um pouco sobre cromatografia de troca iônica. Não tenho qualquer experiência nessa técnica, pois atualmente ela é pouco usada em HPLC. Consultei alguns materiais para elaboração deste post, e quaisquer outras informações adicionais serão bem-vindas.
A cromatografia de troca iônica, foi desenvolvida em meados dos anos 1970, quando foi mostrado que misturas de cátions e ânions podem ser facilmente resolvidas em colunas de HPLC com resinas trocadoras de cátions e ânions como fases estacionárias. É usada para a separação de compostos iônicos ou ionizáveis. O princípio de separação é uma troca de íons do analito com os íons fixados no trocador de íons. A técnica tem sido utilizada há muito tempo, e algumas técnicas analíticas específicas baseadas na troca iônica podem ser vistas como antecessoras da cromatografia líquida de alta eficiência. Um exemplo específico é a análise de aminoácidos, que combina a separação por troca iônica de alta eficiência com a derivatização com ninidrina, sendo uma técnica altamente sensível e seletiva.
Atualmente, a troca iônica raramente é utilizada em HPLC, que é dominado pela cromatografia de fase reversa. Contudo, a técnica de troca iônica se mostra inigualável na separação de biomoléculas, especificamente proteínas e ácidos nucleicos. Também é ainda muito utilizada na análise de íons inorgânicos. A técnica específica utilizada para a análise de íons inorgânicos é chamada de cromatografia iônica.
Mecanismo de retenção
Trocadores Iônicos são preparados anexando cátions ou ânions à uma matriz de suporte. Para satisfazer a necessidade pela eletroneutralidade, os íons fixados são associados com íons de cargas opostas. Estes íons são móveis e podem ser trocados por outros íons de mesma carga, incluindo os íons do analito. Íons diferentes possuem afinidades diferentes daqueles dos íons fixos, que pode ser expressa como uma constante de equilíbrio de troca iônica. As diferentes afinidades são a base da separação por troca iônica. Quando analitos com diferentes afinidades daquela das resinas dos trocadores iônicos são injetadas dentro de uma coluna de troca iônica, aquelas com maior afinidade com as cargas fixadas migrarão através da coluna mais lentamente. A retenção é reduzida aumentando a concentração dos íons competidores na fase móvel. A retenção e a seletividade da separação podem ser influenciadas pelo tipo de íon competidor e sua carga, e/ou pela mudança de carga dos íons do analito, or exemplo, por uma alteração do pH ou uma complexação.
A troca iônica pode ser aplicada para a separação de íons orgânicos e inorgânicos, e também de biomoléculas como aminoácidos, peptídeos, proteínas, ou ácidos nucleicos.
fonte: livro HPLC Columns - Theory, Technology, and Practice Autor: Ewe D. Neue
domingo, 26 de outubro de 2008
sábado, 18 de outubro de 2008
Somente 3 coisas - Parte 1
Me recordo de ler um estudo sobre a aprendizagem em cursos de curta duração. Como dar aulas de cromatografia líquida (LC) é uma parte importante do meu trabalho, minha atenção foi capturada. Os autores alegaram que, em um curso com duração entre 6 e 8 horas, apenas três pontos deveram ser lembrados. Um dos meus cursos para solução de problemas em HPLC tem aproximadamente 200 slides - o que é que isto diz sobre o quão eficaz é a transmissão de conhecimento crítico em cursos de curta duração ?? Como diz o ditado, eu tenho tentado fazer limonada sem limões, e usar o conceito de "somente três coisas" para ajudar a reforçar o que eu acho que são os pontos-chave. Portanto, usaremos este conceito para criar um programa central de manutenção preventiva para seu sistema HPLC.
Degaseificação
Desgaseificação da fase móvel é o único meio mais eficaz para evitar problemas com um sistema HPLC. Cromatógrafos líquidos e ar não foram feitos para ficar juntos! As bombas de HPLC são muito eficazes no bombeamento de líquidos, mas se uma bolha de ar entrar no sistema de bombas, na melhor das circunstâncias, você observará uma redução na taxa de fluxo e uma queda na pressão do sistema. Se a bolha é grande o suficiente, a bomba não irá empurrar o solvente, e se a pressão cai abaixo de um limite predefinido, a bomba vai parar. Em alguns modelos de bomba as bolhas passarão, enquanto que outros modelos vão deixar de funcionar quando uma bolha estiver presente. Depois que a bolha passar pela bomba, ela geralmente vai ficar na solução, enquanto ela passa através da coluna. Mas ao chegar ao detector, a pressão do sistema volta à pressão atmosférica e a bolha pode reaparecer dentro da célula de fluxo do detector, causando picos no cromatograma. Este problema pode ser minimizado pela utilização de um restritor de pressão na saída do detector que forneça pressão suficiente para manter a bolha na solução, até que saia do detector. Evidentemente, devemos ter cuidado para não ultrapassar os limites da pressão da célula de fluxo, ou poderá ocorrer danos ao detector. Embora esses picos de ruídos são os sintomas mais comum de bolhas passando pela célula de fluxo, como para o detector UV por exemplo, alguns detectores podem ser mais sensíveis à presença de ar. Por exemplo, oxigênio dissolvido foi relatado por atenuar a fluorescência de certos compostos quando é utilizado o detector de fluorescência. No modo redutor, o detetor eletroquímico é extremamente sensível ao oxigênio dissolvido. Cuidados devem ser tomados para eliminar oxigênio a partir da fase móvel e evitar tubulações oxigênio-permeável (como PTFE) no caminho dofluxo. Todos estes problemas relacionados com o ar dissolvido na fase móvel podem ser evitados se os cuidados adequados são tomados na degaseificação da fase móvel antes do uso. Durante muitos anos, o padrão ideal para a degaseificação foi a purga com Hélio. Este, simplesmente borbulha Hélio através de um difusor colocado no reservatório de fase móvel. A purga com Hélio é a forma mais eficaz para remover o ar dissolvido da fase móvel, com uma remoção de aproximadamente 80% do oxigênio . Com uma purga bem distribuída, um volume de hélio irá remover quase todo o gás que pode ser retirado de um igual volume de fase móvel. Isto significa que 1 L de hélio borbulhado em 1 L da fase móvel fará o trabalho. O Hélio é a única forma eficaz de remover o oxigênio da fase móvel para evitar problemas específicos de oxigênio dissolvido, tais como a atenuação da fluorescência ou problemas no detector eletroquímico mencionados anteriormente. No entanto, se o objetivo principal é remover o ar dissolvido para que não ocorra a formação de bolhas, a degaseificação por vácuo também é eficaz como uma técnica de degaseificação. A maioria dos sistemas HPLC vendidos hoje vêm com um degaseificador em linha de série ou como opcional. O degaseificador em linha é simples de usar, livre de problemas, e eficaz. Dou-lhe crédito pela enorme redução de queixas ligadas à bolhas que ouvi nos últimos anos.
fonte: traduzido e adaptado http://chromatographyonline.findpharma.com/
Degaseificação
Desgaseificação da fase móvel é o único meio mais eficaz para evitar problemas com um sistema HPLC. Cromatógrafos líquidos e ar não foram feitos para ficar juntos! As bombas de HPLC são muito eficazes no bombeamento de líquidos, mas se uma bolha de ar entrar no sistema de bombas, na melhor das circunstâncias, você observará uma redução na taxa de fluxo e uma queda na pressão do sistema. Se a bolha é grande o suficiente, a bomba não irá empurrar o solvente, e se a pressão cai abaixo de um limite predefinido, a bomba vai parar. Em alguns modelos de bomba as bolhas passarão, enquanto que outros modelos vão deixar de funcionar quando uma bolha estiver presente. Depois que a bolha passar pela bomba, ela geralmente vai ficar na solução, enquanto ela passa através da coluna. Mas ao chegar ao detector, a pressão do sistema volta à pressão atmosférica e a bolha pode reaparecer dentro da célula de fluxo do detector, causando picos no cromatograma. Este problema pode ser minimizado pela utilização de um restritor de pressão na saída do detector que forneça pressão suficiente para manter a bolha na solução, até que saia do detector. Evidentemente, devemos ter cuidado para não ultrapassar os limites da pressão da célula de fluxo, ou poderá ocorrer danos ao detector. Embora esses picos de ruídos são os sintomas mais comum de bolhas passando pela célula de fluxo, como para o detector UV por exemplo, alguns detectores podem ser mais sensíveis à presença de ar. Por exemplo, oxigênio dissolvido foi relatado por atenuar a fluorescência de certos compostos quando é utilizado o detector de fluorescência. No modo redutor, o detetor eletroquímico é extremamente sensível ao oxigênio dissolvido. Cuidados devem ser tomados para eliminar oxigênio a partir da fase móvel e evitar tubulações oxigênio-permeável (como PTFE) no caminho dofluxo. Todos estes problemas relacionados com o ar dissolvido na fase móvel podem ser evitados se os cuidados adequados são tomados na degaseificação da fase móvel antes do uso. Durante muitos anos, o padrão ideal para a degaseificação foi a purga com Hélio. Este, simplesmente borbulha Hélio através de um difusor colocado no reservatório de fase móvel. A purga com Hélio é a forma mais eficaz para remover o ar dissolvido da fase móvel, com uma remoção de aproximadamente 80% do oxigênio . Com uma purga bem distribuída, um volume de hélio irá remover quase todo o gás que pode ser retirado de um igual volume de fase móvel. Isto significa que 1 L de hélio borbulhado em 1 L da fase móvel fará o trabalho. O Hélio é a única forma eficaz de remover o oxigênio da fase móvel para evitar problemas específicos de oxigênio dissolvido, tais como a atenuação da fluorescência ou problemas no detector eletroquímico mencionados anteriormente. No entanto, se o objetivo principal é remover o ar dissolvido para que não ocorra a formação de bolhas, a degaseificação por vácuo também é eficaz como uma técnica de degaseificação. A maioria dos sistemas HPLC vendidos hoje vêm com um degaseificador em linha de série ou como opcional. O degaseificador em linha é simples de usar, livre de problemas, e eficaz. Dou-lhe crédito pela enorme redução de queixas ligadas à bolhas que ouvi nos últimos anos.
fonte: traduzido e adaptado http://chromatographyonline.findpharma.com/
domingo, 12 de outubro de 2008
Breve História e Definição da Cromatografia Líquida
A cromatografia líquida foi definida no início século XX pelo trabalho do botânico russo, Mikhail S. Tswett. Seus estudos pioneiros foram focados em separar compostos (pigmentos de folhas) extraídos de plantas, utilizando um solvente, em uma coluna empacotada com partículas. Tswett encheu uma coluna de vidro com partículas. Dois materiais específicos que ele achou útil foram pulverizados, giz (carbonato de cálcio) e alumina. Ele derramou a sua amostra (extrato de folhas de plantas homogeneizadas) pela coluna e permitiu que a mistura passasse pelo leito de partículas. Em seguida derramou solvente puro. Como a amostra fluiu através da coluna por gravidade, diferentes faixas coloridas puderam ser vistas separando na coluna de vidro, porque alguns componentes foram se movendo mais rapidamente do que outros. Ele relacionou esta separação das faixas de cores diferentes com os diferentes compostos que estavam inicialmente contidos na amostra. Ele tinha criado uma separação analítica desses compostos baseada nas diferentes forças de atração dos compostos químicos com as partículas. Os compostos que foram mais fortemente atraídos pelas partículas fluíram mais lentamente, ao passo que outros compostos mais fortemente atraídos pelo solvente fluíram mais rápido pelo leito de partículas.
Este processo pode ser descrito da seguinte forma: os compostos contidos na amostra, se distribuem ou particionam de forma diferente entre o solvente, chamado de fase móvel, e as partículas, chamado de fase estacionária. Isto faz com que cada composto passe em uma velocidade diferente, criando assim uma separação dos compostos. Tswett cunhou o nome cromatografia (da palavra grega chroma, que significa cor, e graph, que significa grafia - literalmente, grafia das cores) para descrever o seu colorido experimento. Curiosamente, o nome russo Tswett significa cor. Hoje, a cromatografia líquida, em suas diversas formas, se tornou uma das mais poderosas ferramentas da química analítica.
Fonte: traduzido e adaptado http://www.waters.com/waters/home.htm
Este processo pode ser descrito da seguinte forma: os compostos contidos na amostra, se distribuem ou particionam de forma diferente entre o solvente, chamado de fase móvel, e as partículas, chamado de fase estacionária. Isto faz com que cada composto passe em uma velocidade diferente, criando assim uma separação dos compostos. Tswett cunhou o nome cromatografia (da palavra grega chroma, que significa cor, e graph, que significa grafia - literalmente, grafia das cores) para descrever o seu colorido experimento. Curiosamente, o nome russo Tswett significa cor. Hoje, a cromatografia líquida, em suas diversas formas, se tornou uma das mais poderosas ferramentas da química analítica.
Fonte: traduzido e adaptado http://www.waters.com/waters/home.htm
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