Lavagem
A terceira prática fundamental para a operação de HPLC's com confiabilidade é mantê-lo limpo. Se você seguir o caminho através do fluxo do sistema, você notará várias áreas que podem se beneficiar de regular lavagem. Primeiro, os reservatórios de fase móvel devem ser lavados ou trocados com cada novo lote de solvente ou preparação de fase móvel. Um frasco sujo pode contaminar uma fase móvel ou solvente puro. Eu não gosto de usar tampões por mais tempo do que uma semana e solventes orgânicos por mais de um mês sem lavagem do sistema. De preferência, evite o procedimento de encher ou completar o mesmo frasco de solvente ou fase móvel, mas sim crie o hábito de trocar esse frasco toda vez que uma nova fase é preparada ou um frasco de solvente esvaziou. Na sequência vem a bomba. Eu não gosto de desligar uma bomba por mais de alguns minutos se ela contém um tampão não volátil, como o fosfato. Quando evaporar o solvente, como por exemplo ao redor do selo do pistão, material sólido se precipitará e poderá riscar os selos. Este é um dos principais motivos de desgaste prematuro de selos. Se fases móveis tamponadas são deixados no sistema por longos períodos, especialmente se for utilizada acetonitrila, eles podem formar precipitados, que podem causar desgaste de selos e travamento de check-valves. Então, lave a bomba com fase móvel não tamponada antes de desligá-la por períodos prolongados. O injetor automático também deve ser limpo com regularidade. Eu nunca vi um injetor automático que não apresentou vazamentos ou entupimentos. O solvente de lavagem do injetor automático deve ser tratado da mesma forma que a fase móvel, em termos de validade e regular lavagem ou a substituição do reservatório. Contaminantes se acumulam na coluna ao longo do tempo, muitas vezes sendo eluídos e gerando ruído em futuros cromatogramas. Este problema pode ser minimizado com a lavagem da coluna com o solvente forte da fase móvel (por exemplo, metanol ou acetonitrila), no final de cada lote de amostras ou quando a coluna é removida do sistema. Na minha experiência, é mais fácil lavarmos o sistema como indicado acima do que danificar o detector. Por esta razão, cuidar da coluna cromatográfica e manter bons procedimentos de lavagem do sistema evitam problemas de contaminação e entupimentos em células de fluxo dos detectores. Para detectores que trabalham com fase móvel no estado líquido, como os UV's e Fluorescência, somente se houver problemas específicos no detector, como bolhas, sujeira ou entupimento, siga os procedimentos indicados no manual do detector ou chame um especialista. Detectores evaporativos, como os detectores de espalhamento de luz ou detectores de massa a história é diferente. Estes detectores eventualmente criar uma película de contaminantes não volátil e requerem limpeza regularmente.
Resumo: então aí está - desgaseificar, filtrar e lavar. Agora que você recebeu todos os conhecimentos básicos necessários sobre manutenção preventiva. Evidentemente, não é tão simples, mas estas três práticas vão trazer maior confiabilidade no uso e nos resultados de cromatografia do seu laboratório. Boa sorte!
sexta-feira, 19 de dezembro de 2008
terça-feira, 2 de dezembro de 2008
Os 10 maiores mitos sobre colunas de HPLC - Parte 2
Mito 3:
"Coluna de Guarda não afeta a separação"
Falso. Primeiro de tudo, utilizar coluna de guarda é uma boa idéia. No entanto, a escolha errada do tipo de coluna de guarda pode ter um grande efeito sobre a separação cromatográfica. Lembre-se que o objetivo de uma coluna de guarda é proteger a coluna analítica de partículas fortemente incrustantes dos componentes da amostra, e outros materiais particulados indesejáveis. A coluna de guarda é muito mais barata do que a coluna analítica, podendo ser substituída com mais freqüência. Idealmente, a coluna de guarda escolhida deve ter exatamente o mesmo recheio utilizado na fase estacionária (coluna analítica). Se a fase estacionária possui maior capacidade de retenção (por exemplo, tem uma maior carga de carbono), então a coluna de guarda pode afetar a separação de um modo prejudicial, causando variação no tempo de retenção ou mesmo diferenças de seletividade. Se a fase estacionária possuir menor capacidade de retenção, a coluna de guarda pode ou não causar problemas, dependendo diretamente do tipo de fase móvel. Para que a coluna de guarda tenha o mínimo de impacto sobre o desempenho da separação, ela deve ser adequadamente inserida no sistema cromatográfico. Obviamente, a coluna de guarda é colocada entre o injetor e a coluna analítica, mas se adicionarmos muita tubulação (seja muito longa ou diâmetro interno maior), alargamento de banda pode ocorrer e afetar a separação entre os picos. Atualmente existem modelos de colunas que integram ou facilitam a colocação de colunas de guarda, evitando o problema citado acima. Essas colunas possuem um tipo de cartucho ou suporte onde a coluna de guarda é adicionada ao sistema com a adição mínima de tubulação, o que torna esse sistema ideal. Seja qual for a configuração utilizada, a coluna de guarda deve ser colocada ou retirada do sistema sem afetar o funcionamento do HPLC. Teoricamente, a coluna de guarda é um acréscimo de fase estacionária no sistema, o que aumentaria os pratos teóricos e consequentemente a resolução cromatográfica. No entanto, por causa de alguns dos fatores discutidos anteriormente, muitas vezes, a adição de uma coluna de guarda só mantém a separação, na melhor das hipóteses, e por vezes deprecia a partir dele, na pior das hipóteses. A vantagem da coluna de guarda está no aumento de vida útil da coluna analítica e não necessariamente aumentar a eficiência global do sistema cromatográfico.
Mito 4:
"Altas temperaturas sempre levam a melhor separações"
Falso. Como a temperatura aumenta, a viscosidade da fase móvel diminui, portanto, a taxa de transferência de massa do soluto deve aumentar, assim, oferecendo uma melhor eficiência cromatográfica. Verdade, mas além do termo eficiência da coluna , temperatura também pode afetar o fator de retenção e a selectividade. O impacto sobre estes termos podem resultar em melhor resolução (que é isso que estamos preocupados na cromatografia) ou diminuí-la. A retenção geralmente diminui à medida que a temperatura aumenta porque, sendo um parâmetro termodinâmico, o analito prefere ficar na fase móvel e consequentemente é eluído mais cedo dentro da coluna. No entanto, diferentes espécies químicas podem possuir diferentes graus de alteração na sua retenção com a variação da temperatura. Além disso, altas temperaturas podem causar uma baixa seletividade e picos podem ser eluídos perto ou sobre o T0 (volume morto), o que pode dificultar a quantificação destes picos. Tomemos como exemplo a figura 1. Esta série de cromatogramas mostra a separação de sete analgésicos com variação da temperatura de coluna de 20 à 90 ° C.
Pode-se notar várias diferenças entre os cromatogramas. Em primeiro lugar, a retenção de todos os picos é diminuída com temperaturas mais elevadas e os picos que se tornam mais estreito indicam o aumento da eficiência. Segundo, um dos analgésicos, o ácido salicílico, sofre maior variação do tempo de retenção com a temperatura do que os picos 5 e 6. De fato, a ordem dos picos é invertida após a mudança de temperatura de 20 para 40 ° C. Na injeção com temperatura de 30 ° C, o ácido salicílico e o pico de número 6, fenacetina, são coeluídos. Portanto, neste exemplo, temperaturas superiores a 40 ° C resultam em um tempo mais curto de corrida e ainda uma alteração na ordem dos picos se comparado com injeções com temperatura mais baixas. Além disso, uma vantagem em operar com temperaturas mais elevadas é a diminuição da pressão de trabalho da coluna, que permite o uso de fluxos mais altos ou partículas menores. Outro parâmetro experimental que pode causar problemas de performance da coluna é a grande diferença de temperatura entre coluna e fase móvel. Por exemplo, se a coluna é aquecida a 60 ° C e o solvente esteja à temperatura ambiente, esta variação (delta) de temperatura pode causar distorções de picos devido ao choque térmico sofrido parte inicial da coluna. É recomendado que se pré-aqueça a fase móvel quando se utilizar temperaturas muito elevadas na coluna.
fonte: http://chromatographyonline.findpharma.com/
"Coluna de Guarda não afeta a separação"
Falso. Primeiro de tudo, utilizar coluna de guarda é uma boa idéia. No entanto, a escolha errada do tipo de coluna de guarda pode ter um grande efeito sobre a separação cromatográfica. Lembre-se que o objetivo de uma coluna de guarda é proteger a coluna analítica de partículas fortemente incrustantes dos componentes da amostra, e outros materiais particulados indesejáveis. A coluna de guarda é muito mais barata do que a coluna analítica, podendo ser substituída com mais freqüência. Idealmente, a coluna de guarda escolhida deve ter exatamente o mesmo recheio utilizado na fase estacionária (coluna analítica). Se a fase estacionária possui maior capacidade de retenção (por exemplo, tem uma maior carga de carbono), então a coluna de guarda pode afetar a separação de um modo prejudicial, causando variação no tempo de retenção ou mesmo diferenças de seletividade. Se a fase estacionária possuir menor capacidade de retenção, a coluna de guarda pode ou não causar problemas, dependendo diretamente do tipo de fase móvel. Para que a coluna de guarda tenha o mínimo de impacto sobre o desempenho da separação, ela deve ser adequadamente inserida no sistema cromatográfico. Obviamente, a coluna de guarda é colocada entre o injetor e a coluna analítica, mas se adicionarmos muita tubulação (seja muito longa ou diâmetro interno maior), alargamento de banda pode ocorrer e afetar a separação entre os picos. Atualmente existem modelos de colunas que integram ou facilitam a colocação de colunas de guarda, evitando o problema citado acima. Essas colunas possuem um tipo de cartucho ou suporte onde a coluna de guarda é adicionada ao sistema com a adição mínima de tubulação, o que torna esse sistema ideal. Seja qual for a configuração utilizada, a coluna de guarda deve ser colocada ou retirada do sistema sem afetar o funcionamento do HPLC. Teoricamente, a coluna de guarda é um acréscimo de fase estacionária no sistema, o que aumentaria os pratos teóricos e consequentemente a resolução cromatográfica. No entanto, por causa de alguns dos fatores discutidos anteriormente, muitas vezes, a adição de uma coluna de guarda só mantém a separação, na melhor das hipóteses, e por vezes deprecia a partir dele, na pior das hipóteses. A vantagem da coluna de guarda está no aumento de vida útil da coluna analítica e não necessariamente aumentar a eficiência global do sistema cromatográfico.
Mito 4:
"Altas temperaturas sempre levam a melhor separações"
Falso. Como a temperatura aumenta, a viscosidade da fase móvel diminui, portanto, a taxa de transferência de massa do soluto deve aumentar, assim, oferecendo uma melhor eficiência cromatográfica. Verdade, mas além do termo eficiência da coluna , temperatura também pode afetar o fator de retenção e a selectividade. O impacto sobre estes termos podem resultar em melhor resolução (que é isso que estamos preocupados na cromatografia) ou diminuí-la. A retenção geralmente diminui à medida que a temperatura aumenta porque, sendo um parâmetro termodinâmico, o analito prefere ficar na fase móvel e consequentemente é eluído mais cedo dentro da coluna. No entanto, diferentes espécies químicas podem possuir diferentes graus de alteração na sua retenção com a variação da temperatura. Além disso, altas temperaturas podem causar uma baixa seletividade e picos podem ser eluídos perto ou sobre o T0 (volume morto), o que pode dificultar a quantificação destes picos. Tomemos como exemplo a figura 1. Esta série de cromatogramas mostra a separação de sete analgésicos com variação da temperatura de coluna de 20 à 90 ° C.
Pode-se notar várias diferenças entre os cromatogramas. Em primeiro lugar, a retenção de todos os picos é diminuída com temperaturas mais elevadas e os picos que se tornam mais estreito indicam o aumento da eficiência. Segundo, um dos analgésicos, o ácido salicílico, sofre maior variação do tempo de retenção com a temperatura do que os picos 5 e 6. De fato, a ordem dos picos é invertida após a mudança de temperatura de 20 para 40 ° C. Na injeção com temperatura de 30 ° C, o ácido salicílico e o pico de número 6, fenacetina, são coeluídos. Portanto, neste exemplo, temperaturas superiores a 40 ° C resultam em um tempo mais curto de corrida e ainda uma alteração na ordem dos picos se comparado com injeções com temperatura mais baixas. Além disso, uma vantagem em operar com temperaturas mais elevadas é a diminuição da pressão de trabalho da coluna, que permite o uso de fluxos mais altos ou partículas menores. Outro parâmetro experimental que pode causar problemas de performance da coluna é a grande diferença de temperatura entre coluna e fase móvel. Por exemplo, se a coluna é aquecida a 60 ° C e o solvente esteja à temperatura ambiente, esta variação (delta) de temperatura pode causar distorções de picos devido ao choque térmico sofrido parte inicial da coluna. É recomendado que se pré-aqueça a fase móvel quando se utilizar temperaturas muito elevadas na coluna.
fonte: http://chromatographyonline.findpharma.com/
segunda-feira, 17 de novembro de 2008
Somente 3 coisas - Parte 2
Filtração
A menos que sejam tomadas precauções especiais, todas as partículas que entram no sistema HPLC acabam terminando do frit da coluna, eventualmente entupindo a coluna, aumentando a pressão do sistema, e distorcendo picos no cromatograma. Todos os esforços feitos para reduzir a quantidade de partículas inseridas no sistema serão recompensados com o aumento da confiabilidade durante a realização de análises. Existem três grandes fontes de partículas em HPLC: a fase móvel, a amostra e o desgaste dos componentes internos do equipamento.
Se a fase móvel é composta apenas por solventes grau HPLC, não é necessário para filtrar a fase móvel. Isso porque os solventes orgânicos, como acetonitrila ou metanol, são filtradas em membranas 0,2 μm de porosidade durante o processo de fabricação. Da mesma forma, se você comprar água para HPLC ou gerá-la em laboratório com um sistema de purificação, a última etapa de filtração é através de um filtro de 0,2 μm. No entanto, se houver algum aditivo que outrora fora sólido, tais como tampão fosfato, a filtragem da fase móvel é um passo sensato a se tomar. Apesar do sal para tampão poder ser de alta pureza, ele pode não ter se dissolvido completamente, deixando partículas na fase móvel. Qualquer material particulado na fase móvel também pode causar bloqueio das check valves, causando travamento total ou parcial da mesma. Filtragem da fase móvel através de membrana de 0,45 μm é uma forma eficaz para remover quaisquer partículas da fase móvel. Filtros o,2 um podem ser utilizados, mas eles não são muito mais eficazes que 0,45 μm exigidos para esta aplicação e eles filtram muito mais lentamente. Alguns laboratórios escrevem seu POP de Preparação de fase móvel para HPLC determinando que apenas fases móveis preparadas com solventes HPLC (isso inclui água grau HPLC) não precisam ser filtradas, enquanto todas as outras composições de fase móvel exigem filtração antes do uso. Também é importante usar um filtro de linha no reservatório de fase móvel. Este filtro tipicamente têm porosidade de 10 μm, por isso não é um substituto da filtração de fase móvel, mas serve para manter a poeira fora do sistema e também segura a tubulação no fundo do reservatório, trazendo maior confiabilidade operacional.
A amostra é uma segunda fonte de partículas no sistema HPLC. Alguns laboratórios filtram todas as suas amostras em membranas de 0,5 μm antes de colocá-las carrosel do amostrador automático. Esta é uma forma eficaz de eliminar partículas relativas à amostra, mas existe algumas preocupações sobre este processo que podem pesar na decisão do uso deste procedimento. Primeiro, é muito caro - US$ 1 ou mais por filtro - o que pode aumentar significativamente o custo da análise. Além disso, em um método validado, é necessário validar o processo de filtração e usar filtros para cada amostra, e não apenas para as amostras que você acha que precisam de filtração. Você nunca vai conseguir 100% da amostra através do filtro - sempre há poucos microlitros que ficam para atrás. Existe alguma perda do analito por adsorção no filtro ou contaminação por resíduos do próprio filtro? Se houver perda, é a mesma concentração em todas as amostras? Se é para ser usado filtração, todas estas questões devem ser abordadas durante o processo de validação, que pode aumentar o trabalho e as despesas do processo de validação. Um processo de substituição da filtração e que apresenta a mesma eficácia para a maioria das amostras, é centrifugar a amostra em uma centrífuga de bancada por alguns minutos para assentar no fundo qualquer partícula, e depois transferir o sobrenadante para o carrosel de amostras do amostrador automático.
A última grande fonte de partículas em sistemas HPLC é desgaste do sistema de selos de bomba e de rotores, selos e válvulas de injeção. Selos de bomba geralmente irão durar de seis meses à um ano em laboratórios com o uso normal dos sistemas. É indicado substituir estes em manutenções preventivas semestrais ou anuais. O custo é baixo comparado com o gasto de uma coluna entupida por partículas dos selos de bomba. Algumas bombas têm filtros no caminho para reter partículas resultantes do desgaste da bomba, para garantir que essas partículas não vão parar nos pontos mais estreitos do caminho fluídico. Consulte o manual de operação da bomba para encontrar o intervalo recomendado de limpeza ou substituição desses filtros. Selos de injeção também se desgastam ao longo do tempo e precisam ser substituídos. Já válvulas e rotores de injeção demoram mais tempo para apresentarem problemas. Um injetor que trabalha com rotor normalmente dura entre 10000 e 20000 injeções, o que é um número satisfatório mesmo pros laboratórios com rotinas intensas de análise. Evidentemente, o desgaste de selos de bomba e partes do injetor vai aumentar com a presença de mais abrasivo na fase móve. Assim, se você executa rotineiramente gradientes de troca iônica ou uso contínuo de tampões,é esperado que os selos se desgastem mais rapidamente do que se você usar condições de fase reversa (fase móvel de ACN:H2O por exemplo).
Não importa qual fonte de partículas eu estou tentando eliminar, eu sempre uso um filtro de linha de 0,5 μm entre o injetor automático e a coluna, mesmo que uma coluna de guarda esteja sendo utilizada. Este filtro de linha irá entupir no lugar do frit de 2 μm da cabeça da coluna, e pode ser substituído em poucos minutos, com baixo custo. Basta verificar a pressão do sistema cromatográfico no início de cada sequência de amostras. Quando a pressão do sistema aumenta 25% ou cerca de 500 psi, substitua o filtro de linha e volte ao serviço em poucos minutos.
A menos que sejam tomadas precauções especiais, todas as partículas que entram no sistema HPLC acabam terminando do frit da coluna, eventualmente entupindo a coluna, aumentando a pressão do sistema, e distorcendo picos no cromatograma. Todos os esforços feitos para reduzir a quantidade de partículas inseridas no sistema serão recompensados com o aumento da confiabilidade durante a realização de análises. Existem três grandes fontes de partículas em HPLC: a fase móvel, a amostra e o desgaste dos componentes internos do equipamento.
Se a fase móvel é composta apenas por solventes grau HPLC, não é necessário para filtrar a fase móvel. Isso porque os solventes orgânicos, como acetonitrila ou metanol, são filtradas em membranas 0,2 μm de porosidade durante o processo de fabricação. Da mesma forma, se você comprar água para HPLC ou gerá-la em laboratório com um sistema de purificação, a última etapa de filtração é através de um filtro de 0,2 μm. No entanto, se houver algum aditivo que outrora fora sólido, tais como tampão fosfato, a filtragem da fase móvel é um passo sensato a se tomar. Apesar do sal para tampão poder ser de alta pureza, ele pode não ter se dissolvido completamente, deixando partículas na fase móvel. Qualquer material particulado na fase móvel também pode causar bloqueio das check valves, causando travamento total ou parcial da mesma. Filtragem da fase móvel através de membrana de 0,45 μm é uma forma eficaz para remover quaisquer partículas da fase móvel. Filtros o,2 um podem ser utilizados, mas eles não são muito mais eficazes que 0,45 μm exigidos para esta aplicação e eles filtram muito mais lentamente. Alguns laboratórios escrevem seu POP de Preparação de fase móvel para HPLC determinando que apenas fases móveis preparadas com solventes HPLC (isso inclui água grau HPLC) não precisam ser filtradas, enquanto todas as outras composições de fase móvel exigem filtração antes do uso. Também é importante usar um filtro de linha no reservatório de fase móvel. Este filtro tipicamente têm porosidade de 10 μm, por isso não é um substituto da filtração de fase móvel, mas serve para manter a poeira fora do sistema e também segura a tubulação no fundo do reservatório, trazendo maior confiabilidade operacional.
A amostra é uma segunda fonte de partículas no sistema HPLC. Alguns laboratórios filtram todas as suas amostras em membranas de 0,5 μm antes de colocá-las carrosel do amostrador automático. Esta é uma forma eficaz de eliminar partículas relativas à amostra, mas existe algumas preocupações sobre este processo que podem pesar na decisão do uso deste procedimento. Primeiro, é muito caro - US$ 1 ou mais por filtro - o que pode aumentar significativamente o custo da análise. Além disso, em um método validado, é necessário validar o processo de filtração e usar filtros para cada amostra, e não apenas para as amostras que você acha que precisam de filtração. Você nunca vai conseguir 100% da amostra através do filtro - sempre há poucos microlitros que ficam para atrás. Existe alguma perda do analito por adsorção no filtro ou contaminação por resíduos do próprio filtro? Se houver perda, é a mesma concentração em todas as amostras? Se é para ser usado filtração, todas estas questões devem ser abordadas durante o processo de validação, que pode aumentar o trabalho e as despesas do processo de validação. Um processo de substituição da filtração e que apresenta a mesma eficácia para a maioria das amostras, é centrifugar a amostra em uma centrífuga de bancada por alguns minutos para assentar no fundo qualquer partícula, e depois transferir o sobrenadante para o carrosel de amostras do amostrador automático.
A última grande fonte de partículas em sistemas HPLC é desgaste do sistema de selos de bomba e de rotores, selos e válvulas de injeção. Selos de bomba geralmente irão durar de seis meses à um ano em laboratórios com o uso normal dos sistemas. É indicado substituir estes em manutenções preventivas semestrais ou anuais. O custo é baixo comparado com o gasto de uma coluna entupida por partículas dos selos de bomba. Algumas bombas têm filtros no caminho para reter partículas resultantes do desgaste da bomba, para garantir que essas partículas não vão parar nos pontos mais estreitos do caminho fluídico. Consulte o manual de operação da bomba para encontrar o intervalo recomendado de limpeza ou substituição desses filtros. Selos de injeção também se desgastam ao longo do tempo e precisam ser substituídos. Já válvulas e rotores de injeção demoram mais tempo para apresentarem problemas. Um injetor que trabalha com rotor normalmente dura entre 10000 e 20000 injeções, o que é um número satisfatório mesmo pros laboratórios com rotinas intensas de análise. Evidentemente, o desgaste de selos de bomba e partes do injetor vai aumentar com a presença de mais abrasivo na fase móve. Assim, se você executa rotineiramente gradientes de troca iônica ou uso contínuo de tampões,é esperado que os selos se desgastem mais rapidamente do que se você usar condições de fase reversa (fase móvel de ACN:H2O por exemplo).
Não importa qual fonte de partículas eu estou tentando eliminar, eu sempre uso um filtro de linha de 0,5 μm entre o injetor automático e a coluna, mesmo que uma coluna de guarda esteja sendo utilizada. Este filtro de linha irá entupir no lugar do frit de 2 μm da cabeça da coluna, e pode ser substituído em poucos minutos, com baixo custo. Basta verificar a pressão do sistema cromatográfico no início de cada sequência de amostras. Quando a pressão do sistema aumenta 25% ou cerca de 500 psi, substitua o filtro de linha e volte ao serviço em poucos minutos.
domingo, 9 de novembro de 2008
Os 10 maiores mitos sobre colunas de HPLC - Parte 1
Mito 1:
"Você não pode inverter uma coluna HPLC"
Falso. Na prática, uma coluna de HPLC é empacotada com pressões muito mais elevadas que sua pressão máxima de trabalho. Assim, se o solvente adequado foi utilizado para estabilizar o leito empacatado, uma coluna bem empacotada deve ser capaz de trabalhar em ambos os sentidos. Algumas das razões do por que iríamos querer inverter o sentido do fluxo de uma coluna cromatográfica são as operações de lavagem de coluna com fluxo invertido, retirando amostras fortemente adsorvidas na sua entrada (um percurso mais curto do que empurrar os materiais insolúveis e tentar passá-los por todo o comprimento da coluna), e retirar partículas presas para diminuir a pressão de trabalho.
Há uma exceção para inverter o fluxo de uma coluna HPLC. Se o fabricante da coluna utilizou um frit de porosidade maior na entrada da coluna, a inversão da coluna poderá arrastar partículas do leito empacotado para fora da coluna. Quando a coluna é empacotada em uma fábrica, a porosidade dos frits nas saídas da coluna devem ser menor do que o menor tamanho de partícula da coluna. Por exemplo, se a coluna empacotada tem um diâmetro médio de 5 μm e uma distribuição de tamanho de partículas de 3-7 μm, o frit utilizado nas saídas da coluna devem ser inferior a 3 μm para evitar que partículas irão escapar do leito empacotado durante o uso da coluna. Para esse exemplo, a maioria dos fabricantes utilizam um frit de 2 μm.
Por que um fabricante tem diferentes porosidades de frits na entrada e saída da coluna ? Simples. Um frit de maior porosidade tem menor tendência de entupir do que um frit de menor porosidade. Um frit de 0,5 μm vai entupir mais rápido do que um frit de 2 μm. Então, para impedir o rápido aumento de pressão e de reclamações de clientes, o fabricante utiliza um frit de maior porosidade na entrada da coluna. Normalmente, a coluna é marcada com uma seta que indica que ela deve ser utilizada em uma só direção. Antes de inverter uma coluna HPLC, o melhor é consultar as instruções de utilização da coluna ou verifique com o fabricante coluna para ver se a coluna pode ser invertida.
Mito 2:
"Todas as colunas C18 (L1) são iguais"
Falso. No início da técnica de HPLC, octadecilsilano (mais frequentemente referida como um ODS ou C18) foi uma das primeiras fases estacionárias ligada que se tornaram disponíveis para a nova técnica chamada "cromatografia de fase reversa". Ele se tornou a fase estacionária padrão para a cromatografia de fase reversa, e foi rapidamente adotada pela maioria dos praticantes. Como a indústria farmacêutica foi um dos primeiros setores ao utilizar HPLC e os órgãos reguladores não queriam indicar um determinado fabricante de coluna, o FDA e a USP desenvolveram um sistema de classificação que deu um designação genérica para cada novo método que foi apresentado no âmbito de uma nova aplicação de uma droga. Para as colunas HPLC, uma denominação "L" foi dada e a fase estacionária C18 foi utilizada na maioria dos métodos testados, tornando-se "L1". Como fases diferentes foram adicionados, elas receberam seu próprio "L" seguido de um número (por exemplo, L7 - C8, L10 - CN, L11 - Fenil e assim por diante).
Infelizmente, este sistema de designação revelou-se pouco confiável, pois cada marca de coluna C18 foi sintetizada diferentemente, usando sílica gel como material base e resultando em colunas de fase reversa com propriedades diferentes. Para exemplo, alguns fabricantes utilizam octadecilmonoclorosilano e uma sílica gel de baixa superfície, enquanto outros utilizaram o mesmo silano, mas ele ligado a uma silica gel de maior superfície. Estas duas colunas C18 teriam comportamento diferente, com esta última tendo mais C18 do que a primeira. Uma baixa cobertura da fase ligada, deixa silanóis que não reagiram e causam mecanismos de retenção variados. Alguns fabricantes utilizam di e triclorosilanos na polimerização para formar uma camada mais espessa, com diferentes propriedades de difusão. Para reduzir a quantidade de silanóis que não reagiram e estabilizar a fase ligada, alguns fabricantes cobrem estes silanóis com um pequeno silanol (por exemplo, trimetilmonoclorosilano). Silanóis às vezes são responsáveis pela cauda nos compostos básicos em faixas de pH intermediários. Alguns fabricantes vão ainda mais longe e aplicam uma segunda camada de um pequeno silanol para proporcionar uma superfície ainda mais inerte. Alguns fabricantes estão utilizando polímeros como material de suporte (substituindo a silica) e em seguida ligando moléculas de C18 à sua superfície, resultando em uma C18 com empacotamento totalmente diferente, mas ainda assim sendo considerada uma "L1". Outros usam organoalcoxisilanos que possuem um grau diferente de reatividade e podem produzir uma C18 de fase ligada ligeiramente diferente do que seria com um reagente organoclorosilado.
Portanto, a declaração de que "uma C18 não é igual a outra C18" é válido ainda hoje. Todas as fases C18 não são iguais e o usuário deve ter certeza que uma vez que um método é desenvolvido, ele indique o P/N da coluna para se garantir um método consistente e robusto. Nos últimos tempos, especialistas têm estudado um grande número de fases C18, numa tentativa de determinar que tenham as mesmas características de tempo de retenção e seletividade. Pela caracterização das fases baseadas em pelo menos cinco parâmetros de retenção, eles têm classificado fases com um valor numérico para que um possa ser capaz de escolher a fase mais similar em características de performance no caso da fase C18 de um determinado fabricante não estar disponível para uso. Esse levantamento também pode encontrar uma fase C18 totalmente diferentes das atuais, podendo abrir o leque de opções de fase C18 para o desenvolvimento de novos métodos.
fonte: http://www.lcgceurope.com
"Você não pode inverter uma coluna HPLC"
Falso. Na prática, uma coluna de HPLC é empacotada com pressões muito mais elevadas que sua pressão máxima de trabalho. Assim, se o solvente adequado foi utilizado para estabilizar o leito empacatado, uma coluna bem empacotada deve ser capaz de trabalhar em ambos os sentidos. Algumas das razões do por que iríamos querer inverter o sentido do fluxo de uma coluna cromatográfica são as operações de lavagem de coluna com fluxo invertido, retirando amostras fortemente adsorvidas na sua entrada (um percurso mais curto do que empurrar os materiais insolúveis e tentar passá-los por todo o comprimento da coluna), e retirar partículas presas para diminuir a pressão de trabalho.
Há uma exceção para inverter o fluxo de uma coluna HPLC. Se o fabricante da coluna utilizou um frit de porosidade maior na entrada da coluna, a inversão da coluna poderá arrastar partículas do leito empacotado para fora da coluna. Quando a coluna é empacotada em uma fábrica, a porosidade dos frits nas saídas da coluna devem ser menor do que o menor tamanho de partícula da coluna. Por exemplo, se a coluna empacotada tem um diâmetro médio de 5 μm e uma distribuição de tamanho de partículas de 3-7 μm, o frit utilizado nas saídas da coluna devem ser inferior a 3 μm para evitar que partículas irão escapar do leito empacotado durante o uso da coluna. Para esse exemplo, a maioria dos fabricantes utilizam um frit de 2 μm.
Por que um fabricante tem diferentes porosidades de frits na entrada e saída da coluna ? Simples. Um frit de maior porosidade tem menor tendência de entupir do que um frit de menor porosidade. Um frit de 0,5 μm vai entupir mais rápido do que um frit de 2 μm. Então, para impedir o rápido aumento de pressão e de reclamações de clientes, o fabricante utiliza um frit de maior porosidade na entrada da coluna. Normalmente, a coluna é marcada com uma seta que indica que ela deve ser utilizada em uma só direção. Antes de inverter uma coluna HPLC, o melhor é consultar as instruções de utilização da coluna ou verifique com o fabricante coluna para ver se a coluna pode ser invertida.
Mito 2:
"Todas as colunas C18 (L1) são iguais"
Falso. No início da técnica de HPLC, octadecilsilano (mais frequentemente referida como um ODS ou C18) foi uma das primeiras fases estacionárias ligada que se tornaram disponíveis para a nova técnica chamada "cromatografia de fase reversa". Ele se tornou a fase estacionária padrão para a cromatografia de fase reversa, e foi rapidamente adotada pela maioria dos praticantes. Como a indústria farmacêutica foi um dos primeiros setores ao utilizar HPLC e os órgãos reguladores não queriam indicar um determinado fabricante de coluna, o FDA e a USP desenvolveram um sistema de classificação que deu um designação genérica para cada novo método que foi apresentado no âmbito de uma nova aplicação de uma droga. Para as colunas HPLC, uma denominação "L" foi dada e a fase estacionária C18 foi utilizada na maioria dos métodos testados, tornando-se "L1". Como fases diferentes foram adicionados, elas receberam seu próprio "L" seguido de um número (por exemplo, L7 - C8, L10 - CN, L11 - Fenil e assim por diante).
Infelizmente, este sistema de designação revelou-se pouco confiável, pois cada marca de coluna C18 foi sintetizada diferentemente, usando sílica gel como material base e resultando em colunas de fase reversa com propriedades diferentes. Para exemplo, alguns fabricantes utilizam octadecilmonoclorosilano e uma sílica gel de baixa superfície, enquanto outros utilizaram o mesmo silano, mas ele ligado a uma silica gel de maior superfície. Estas duas colunas C18 teriam comportamento diferente, com esta última tendo mais C18 do que a primeira. Uma baixa cobertura da fase ligada, deixa silanóis que não reagiram e causam mecanismos de retenção variados. Alguns fabricantes utilizam di e triclorosilanos na polimerização para formar uma camada mais espessa, com diferentes propriedades de difusão. Para reduzir a quantidade de silanóis que não reagiram e estabilizar a fase ligada, alguns fabricantes cobrem estes silanóis com um pequeno silanol (por exemplo, trimetilmonoclorosilano). Silanóis às vezes são responsáveis pela cauda nos compostos básicos em faixas de pH intermediários. Alguns fabricantes vão ainda mais longe e aplicam uma segunda camada de um pequeno silanol para proporcionar uma superfície ainda mais inerte. Alguns fabricantes estão utilizando polímeros como material de suporte (substituindo a silica) e em seguida ligando moléculas de C18 à sua superfície, resultando em uma C18 com empacotamento totalmente diferente, mas ainda assim sendo considerada uma "L1". Outros usam organoalcoxisilanos que possuem um grau diferente de reatividade e podem produzir uma C18 de fase ligada ligeiramente diferente do que seria com um reagente organoclorosilado.
Portanto, a declaração de que "uma C18 não é igual a outra C18" é válido ainda hoje. Todas as fases C18 não são iguais e o usuário deve ter certeza que uma vez que um método é desenvolvido, ele indique o P/N da coluna para se garantir um método consistente e robusto. Nos últimos tempos, especialistas têm estudado um grande número de fases C18, numa tentativa de determinar que tenham as mesmas características de tempo de retenção e seletividade. Pela caracterização das fases baseadas em pelo menos cinco parâmetros de retenção, eles têm classificado fases com um valor numérico para que um possa ser capaz de escolher a fase mais similar em características de performance no caso da fase C18 de um determinado fabricante não estar disponível para uso. Esse levantamento também pode encontrar uma fase C18 totalmente diferentes das atuais, podendo abrir o leque de opções de fase C18 para o desenvolvimento de novos métodos.
fonte: http://www.lcgceurope.com
domingo, 26 de outubro de 2008
Cromatografia de Troca Iônica - Parte 1
Atendendo às solicitações de um dos participantes do blog, vamos falar um pouco sobre cromatografia de troca iônica. Não tenho qualquer experiência nessa técnica, pois atualmente ela é pouco usada em HPLC. Consultei alguns materiais para elaboração deste post, e quaisquer outras informações adicionais serão bem-vindas.
A cromatografia de troca iônica, foi desenvolvida em meados dos anos 1970, quando foi mostrado que misturas de cátions e ânions podem ser facilmente resolvidas em colunas de HPLC com resinas trocadoras de cátions e ânions como fases estacionárias. É usada para a separação de compostos iônicos ou ionizáveis. O princípio de separação é uma troca de íons do analito com os íons fixados no trocador de íons. A técnica tem sido utilizada há muito tempo, e algumas técnicas analíticas específicas baseadas na troca iônica podem ser vistas como antecessoras da cromatografia líquida de alta eficiência. Um exemplo específico é a análise de aminoácidos, que combina a separação por troca iônica de alta eficiência com a derivatização com ninidrina, sendo uma técnica altamente sensível e seletiva.
Atualmente, a troca iônica raramente é utilizada em HPLC, que é dominado pela cromatografia de fase reversa. Contudo, a técnica de troca iônica se mostra inigualável na separação de biomoléculas, especificamente proteínas e ácidos nucleicos. Também é ainda muito utilizada na análise de íons inorgânicos. A técnica específica utilizada para a análise de íons inorgânicos é chamada de cromatografia iônica.
Mecanismo de retenção
Trocadores Iônicos são preparados anexando cátions ou ânions à uma matriz de suporte. Para satisfazer a necessidade pela eletroneutralidade, os íons fixados são associados com íons de cargas opostas. Estes íons são móveis e podem ser trocados por outros íons de mesma carga, incluindo os íons do analito. Íons diferentes possuem afinidades diferentes daqueles dos íons fixos, que pode ser expressa como uma constante de equilíbrio de troca iônica. As diferentes afinidades são a base da separação por troca iônica. Quando analitos com diferentes afinidades daquela das resinas dos trocadores iônicos são injetadas dentro de uma coluna de troca iônica, aquelas com maior afinidade com as cargas fixadas migrarão através da coluna mais lentamente. A retenção é reduzida aumentando a concentração dos íons competidores na fase móvel. A retenção e a seletividade da separação podem ser influenciadas pelo tipo de íon competidor e sua carga, e/ou pela mudança de carga dos íons do analito, or exemplo, por uma alteração do pH ou uma complexação.
A troca iônica pode ser aplicada para a separação de íons orgânicos e inorgânicos, e também de biomoléculas como aminoácidos, peptídeos, proteínas, ou ácidos nucleicos.
fonte: livro HPLC Columns - Theory, Technology, and Practice Autor: Ewe D. Neue
A cromatografia de troca iônica, foi desenvolvida em meados dos anos 1970, quando foi mostrado que misturas de cátions e ânions podem ser facilmente resolvidas em colunas de HPLC com resinas trocadoras de cátions e ânions como fases estacionárias. É usada para a separação de compostos iônicos ou ionizáveis. O princípio de separação é uma troca de íons do analito com os íons fixados no trocador de íons. A técnica tem sido utilizada há muito tempo, e algumas técnicas analíticas específicas baseadas na troca iônica podem ser vistas como antecessoras da cromatografia líquida de alta eficiência. Um exemplo específico é a análise de aminoácidos, que combina a separação por troca iônica de alta eficiência com a derivatização com ninidrina, sendo uma técnica altamente sensível e seletiva.
Atualmente, a troca iônica raramente é utilizada em HPLC, que é dominado pela cromatografia de fase reversa. Contudo, a técnica de troca iônica se mostra inigualável na separação de biomoléculas, especificamente proteínas e ácidos nucleicos. Também é ainda muito utilizada na análise de íons inorgânicos. A técnica específica utilizada para a análise de íons inorgânicos é chamada de cromatografia iônica.
Mecanismo de retenção
Trocadores Iônicos são preparados anexando cátions ou ânions à uma matriz de suporte. Para satisfazer a necessidade pela eletroneutralidade, os íons fixados são associados com íons de cargas opostas. Estes íons são móveis e podem ser trocados por outros íons de mesma carga, incluindo os íons do analito. Íons diferentes possuem afinidades diferentes daqueles dos íons fixos, que pode ser expressa como uma constante de equilíbrio de troca iônica. As diferentes afinidades são a base da separação por troca iônica. Quando analitos com diferentes afinidades daquela das resinas dos trocadores iônicos são injetadas dentro de uma coluna de troca iônica, aquelas com maior afinidade com as cargas fixadas migrarão através da coluna mais lentamente. A retenção é reduzida aumentando a concentração dos íons competidores na fase móvel. A retenção e a seletividade da separação podem ser influenciadas pelo tipo de íon competidor e sua carga, e/ou pela mudança de carga dos íons do analito, or exemplo, por uma alteração do pH ou uma complexação.
A troca iônica pode ser aplicada para a separação de íons orgânicos e inorgânicos, e também de biomoléculas como aminoácidos, peptídeos, proteínas, ou ácidos nucleicos.
fonte: livro HPLC Columns - Theory, Technology, and Practice Autor: Ewe D. Neue
sábado, 18 de outubro de 2008
Somente 3 coisas - Parte 1
Me recordo de ler um estudo sobre a aprendizagem em cursos de curta duração. Como dar aulas de cromatografia líquida (LC) é uma parte importante do meu trabalho, minha atenção foi capturada. Os autores alegaram que, em um curso com duração entre 6 e 8 horas, apenas três pontos deveram ser lembrados. Um dos meus cursos para solução de problemas em HPLC tem aproximadamente 200 slides - o que é que isto diz sobre o quão eficaz é a transmissão de conhecimento crítico em cursos de curta duração ?? Como diz o ditado, eu tenho tentado fazer limonada sem limões, e usar o conceito de "somente três coisas" para ajudar a reforçar o que eu acho que são os pontos-chave. Portanto, usaremos este conceito para criar um programa central de manutenção preventiva para seu sistema HPLC.
Degaseificação
Desgaseificação da fase móvel é o único meio mais eficaz para evitar problemas com um sistema HPLC. Cromatógrafos líquidos e ar não foram feitos para ficar juntos! As bombas de HPLC são muito eficazes no bombeamento de líquidos, mas se uma bolha de ar entrar no sistema de bombas, na melhor das circunstâncias, você observará uma redução na taxa de fluxo e uma queda na pressão do sistema. Se a bolha é grande o suficiente, a bomba não irá empurrar o solvente, e se a pressão cai abaixo de um limite predefinido, a bomba vai parar. Em alguns modelos de bomba as bolhas passarão, enquanto que outros modelos vão deixar de funcionar quando uma bolha estiver presente. Depois que a bolha passar pela bomba, ela geralmente vai ficar na solução, enquanto ela passa através da coluna. Mas ao chegar ao detector, a pressão do sistema volta à pressão atmosférica e a bolha pode reaparecer dentro da célula de fluxo do detector, causando picos no cromatograma. Este problema pode ser minimizado pela utilização de um restritor de pressão na saída do detector que forneça pressão suficiente para manter a bolha na solução, até que saia do detector. Evidentemente, devemos ter cuidado para não ultrapassar os limites da pressão da célula de fluxo, ou poderá ocorrer danos ao detector. Embora esses picos de ruídos são os sintomas mais comum de bolhas passando pela célula de fluxo, como para o detector UV por exemplo, alguns detectores podem ser mais sensíveis à presença de ar. Por exemplo, oxigênio dissolvido foi relatado por atenuar a fluorescência de certos compostos quando é utilizado o detector de fluorescência. No modo redutor, o detetor eletroquímico é extremamente sensível ao oxigênio dissolvido. Cuidados devem ser tomados para eliminar oxigênio a partir da fase móvel e evitar tubulações oxigênio-permeável (como PTFE) no caminho dofluxo. Todos estes problemas relacionados com o ar dissolvido na fase móvel podem ser evitados se os cuidados adequados são tomados na degaseificação da fase móvel antes do uso. Durante muitos anos, o padrão ideal para a degaseificação foi a purga com Hélio. Este, simplesmente borbulha Hélio através de um difusor colocado no reservatório de fase móvel. A purga com Hélio é a forma mais eficaz para remover o ar dissolvido da fase móvel, com uma remoção de aproximadamente 80% do oxigênio . Com uma purga bem distribuída, um volume de hélio irá remover quase todo o gás que pode ser retirado de um igual volume de fase móvel. Isto significa que 1 L de hélio borbulhado em 1 L da fase móvel fará o trabalho. O Hélio é a única forma eficaz de remover o oxigênio da fase móvel para evitar problemas específicos de oxigênio dissolvido, tais como a atenuação da fluorescência ou problemas no detector eletroquímico mencionados anteriormente. No entanto, se o objetivo principal é remover o ar dissolvido para que não ocorra a formação de bolhas, a degaseificação por vácuo também é eficaz como uma técnica de degaseificação. A maioria dos sistemas HPLC vendidos hoje vêm com um degaseificador em linha de série ou como opcional. O degaseificador em linha é simples de usar, livre de problemas, e eficaz. Dou-lhe crédito pela enorme redução de queixas ligadas à bolhas que ouvi nos últimos anos.
fonte: traduzido e adaptado http://chromatographyonline.findpharma.com/
Degaseificação
Desgaseificação da fase móvel é o único meio mais eficaz para evitar problemas com um sistema HPLC. Cromatógrafos líquidos e ar não foram feitos para ficar juntos! As bombas de HPLC são muito eficazes no bombeamento de líquidos, mas se uma bolha de ar entrar no sistema de bombas, na melhor das circunstâncias, você observará uma redução na taxa de fluxo e uma queda na pressão do sistema. Se a bolha é grande o suficiente, a bomba não irá empurrar o solvente, e se a pressão cai abaixo de um limite predefinido, a bomba vai parar. Em alguns modelos de bomba as bolhas passarão, enquanto que outros modelos vão deixar de funcionar quando uma bolha estiver presente. Depois que a bolha passar pela bomba, ela geralmente vai ficar na solução, enquanto ela passa através da coluna. Mas ao chegar ao detector, a pressão do sistema volta à pressão atmosférica e a bolha pode reaparecer dentro da célula de fluxo do detector, causando picos no cromatograma. Este problema pode ser minimizado pela utilização de um restritor de pressão na saída do detector que forneça pressão suficiente para manter a bolha na solução, até que saia do detector. Evidentemente, devemos ter cuidado para não ultrapassar os limites da pressão da célula de fluxo, ou poderá ocorrer danos ao detector. Embora esses picos de ruídos são os sintomas mais comum de bolhas passando pela célula de fluxo, como para o detector UV por exemplo, alguns detectores podem ser mais sensíveis à presença de ar. Por exemplo, oxigênio dissolvido foi relatado por atenuar a fluorescência de certos compostos quando é utilizado o detector de fluorescência. No modo redutor, o detetor eletroquímico é extremamente sensível ao oxigênio dissolvido. Cuidados devem ser tomados para eliminar oxigênio a partir da fase móvel e evitar tubulações oxigênio-permeável (como PTFE) no caminho dofluxo. Todos estes problemas relacionados com o ar dissolvido na fase móvel podem ser evitados se os cuidados adequados são tomados na degaseificação da fase móvel antes do uso. Durante muitos anos, o padrão ideal para a degaseificação foi a purga com Hélio. Este, simplesmente borbulha Hélio através de um difusor colocado no reservatório de fase móvel. A purga com Hélio é a forma mais eficaz para remover o ar dissolvido da fase móvel, com uma remoção de aproximadamente 80% do oxigênio . Com uma purga bem distribuída, um volume de hélio irá remover quase todo o gás que pode ser retirado de um igual volume de fase móvel. Isto significa que 1 L de hélio borbulhado em 1 L da fase móvel fará o trabalho. O Hélio é a única forma eficaz de remover o oxigênio da fase móvel para evitar problemas específicos de oxigênio dissolvido, tais como a atenuação da fluorescência ou problemas no detector eletroquímico mencionados anteriormente. No entanto, se o objetivo principal é remover o ar dissolvido para que não ocorra a formação de bolhas, a degaseificação por vácuo também é eficaz como uma técnica de degaseificação. A maioria dos sistemas HPLC vendidos hoje vêm com um degaseificador em linha de série ou como opcional. O degaseificador em linha é simples de usar, livre de problemas, e eficaz. Dou-lhe crédito pela enorme redução de queixas ligadas à bolhas que ouvi nos últimos anos.
fonte: traduzido e adaptado http://chromatographyonline.findpharma.com/
domingo, 12 de outubro de 2008
Breve História e Definição da Cromatografia Líquida
A cromatografia líquida foi definida no início século XX pelo trabalho do botânico russo, Mikhail S. Tswett. Seus estudos pioneiros foram focados em separar compostos (pigmentos de folhas) extraídos de plantas, utilizando um solvente, em uma coluna empacotada com partículas. Tswett encheu uma coluna de vidro com partículas. Dois materiais específicos que ele achou útil foram pulverizados, giz (carbonato de cálcio) e alumina. Ele derramou a sua amostra (extrato de folhas de plantas homogeneizadas) pela coluna e permitiu que a mistura passasse pelo leito de partículas. Em seguida derramou solvente puro. Como a amostra fluiu através da coluna por gravidade, diferentes faixas coloridas puderam ser vistas separando na coluna de vidro, porque alguns componentes foram se movendo mais rapidamente do que outros. Ele relacionou esta separação das faixas de cores diferentes com os diferentes compostos que estavam inicialmente contidos na amostra. Ele tinha criado uma separação analítica desses compostos baseada nas diferentes forças de atração dos compostos químicos com as partículas. Os compostos que foram mais fortemente atraídos pelas partículas fluíram mais lentamente, ao passo que outros compostos mais fortemente atraídos pelo solvente fluíram mais rápido pelo leito de partículas.
Este processo pode ser descrito da seguinte forma: os compostos contidos na amostra, se distribuem ou particionam de forma diferente entre o solvente, chamado de fase móvel, e as partículas, chamado de fase estacionária. Isto faz com que cada composto passe em uma velocidade diferente, criando assim uma separação dos compostos. Tswett cunhou o nome cromatografia (da palavra grega chroma, que significa cor, e graph, que significa grafia - literalmente, grafia das cores) para descrever o seu colorido experimento. Curiosamente, o nome russo Tswett significa cor. Hoje, a cromatografia líquida, em suas diversas formas, se tornou uma das mais poderosas ferramentas da química analítica.
Fonte: traduzido e adaptado http://www.waters.com/waters/home.htm
Este processo pode ser descrito da seguinte forma: os compostos contidos na amostra, se distribuem ou particionam de forma diferente entre o solvente, chamado de fase móvel, e as partículas, chamado de fase estacionária. Isto faz com que cada composto passe em uma velocidade diferente, criando assim uma separação dos compostos. Tswett cunhou o nome cromatografia (da palavra grega chroma, que significa cor, e graph, que significa grafia - literalmente, grafia das cores) para descrever o seu colorido experimento. Curiosamente, o nome russo Tswett significa cor. Hoje, a cromatografia líquida, em suas diversas formas, se tornou uma das mais poderosas ferramentas da química analítica.
Fonte: traduzido e adaptado http://www.waters.com/waters/home.htm
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