HPLC na prática: Dicas para uma rotina eficiente na cromatografia líquida – parte 2

Não há nada mais frustrante para um cromatografista do que chegar no dia seguinte em frente do seu HPLC e perceber que aquela sêquencia colocada pra rodar no dia anterior foi perdida.

Não importa se era um teste, 5 lotes de produto final, estabilidade ou uma validação de método, aquele instante da descoberta é frustrante e a única coisa que queremos saber é o que causou o problema.

Em geral procuramos por erros grandes para justificar o problema: uma coluna saturada, uma fase móvel preparada errada ou um defeito no equipamento.

Mas na maioria das vezes não encontramos o tal “problema”, e dependendo do nível de compliance da empresa em que você atua, alguns dias serão perdidos tentando justificar o erro, sem encontrar o real motivo para o problema.

O que muitos usuários de cromatografia líquida ainda não perceberam é que em geral, este “problema” grande que estamos procurando nada mais é do que a somatória de pequenos erros gerados na nossa rotina de preparação do sistema HPLC para aquela análise.

Nos próximos posts iremos tratar em detalhes quais são os cuidados que os cromatografistas experientes utilizam em sua rotina para garantir uma rotina produtiva e confiável.

A importância da limpeza do seu sistema HPLC: acompanho a rotina de grandes laboratórios de cromatografia no Brasil há muitos anos, e a observação atenta da rotina destes lugares revela algo importante: falta cuidado e limpeza nos sistema de cromatografia líquida na maioria destes lugares.

Como causa para esta afirmação temos a rotina extremamente sobrecarregada do uso dos HPLC`s, a falta de conhecimento sobre a importância desta limpeza e sobre como fazer isso de maneira eficiente, além de outras possíveis causas.

Neste post vamos explicar como fazer esta limpeza de maneira extremamente eficiente, aumentando a produtividade e diminuendo o números de reanálises e reinjeções.

Um sistema HPLC sujo pode ser o causador de inúmeros tipos de sintomas:

- aumento da pressão de trabalho devido à entupimentos parciais

em bombas, injetores e detectores;

- ruídos de linha de base e picos não desejados;

- vazamentos e precipitações;

- supressão de picos de interesse;

- entre outros problemas.

A limpeza de um sistema deve ser dividida em 3 situações principais:

- limpeza após uma rotina de análise;

- limpeza ao final do dia;

- limpeza para longos períodos de parada.

Nota importante: neste post estamos considerando o uso de

colunas para fase reversa, a técnica dominante nos dias atuais

quando o assunto é cromatografia líquida. As dicas aqui não são

para limpeza de colunas, mas sim para limpeza de Sistemas HPLC.

Caso sua coluna tenha alguma peculiaridade nos cuidados, siga

atentamente antes de fazer qualquer outro tipo de procedimento.

Antes de tudo, se sua análise utiliza tampões, soluções acidificadas

ou basificadas, troque esta solução por água e passe no sistema por

pelo menos 15 minutos (fluxo e % de solventes do método

utilizado). No caso de gradientes, corra o gradiente inteiro com a

água substituindo o tampão (15 minutos no mínimo). Em seguida,

passe um solvente forte (geralmente ACN ou MeOH) por mais 15

minutos pelo menos (no caso de gradientes corra pelo menos um

gradiente inteiro).

Caso você tenha o uso de equipamentos dedicados (um sistema

HPLC que roda a mesma análise diariamente) e quer manter o

sistema “pronto”, não desligue seu HPLC durante a noite e

mantenha o fluxo de fase móvel em 0,2 mL / min, evitando assim

precipitação e crescimento microbiano. Se seu sistema fica parado

durante a noite, mantenha sempre os canais purgados com solvente

forte (MeOH ou ACN). Caso seu sistema for ficar parado por mais de

5 dias sem uso, é indicado manter o mesmo em solução MeOH: H2O

(50:50).

Dicas práticas:

- se seu laboratório utiliza muito tampão (principalmente tampões

com concentrações acima de 50 mM), é extremamente indicado o

uso de dispositivo de lavagem de selos de bomba, para aumentar a

durabilidade dos selos de pistão (H2O:IPA 90:10);

- mantenha as soluções de uso sempres frescas, trocando-as

regularmente;

- se seu sistema apresenta sais nas conexões (vazamentos), limpe-os

para evitar contaminação de suas injeções;

- atenção com soluções de lavagem de agulha, pois esta deve ser

preferencialmente o seu diluente (atenção com sais e reagentes

agressivos utilizados no seu diluente) ou solvente mais forte, ou a

limpeza da agulha será ineficiente;

- frascos de solventes bem tampados evitam entupimentos dos

filtros pescadores e a evaporação de solventes tóxicos pro

ambiente;

- sempre verifique nível de descarte para evitar derramamentos em

seu laboratório e / ou bancadas. 

HPLC na prática: Dicas para uma rotina eficiente na cromatografia líquida – parte 1

Não há nada mais frustrante para um cromatografista do que chegar no dia seguinte em frente do seu HPLC e perceber que aquela sêquencia colocada pra rodar no dia anterior foi perdida.

Não importa se era um teste, 5 lotes de produto final, estabilidade ou uma validação de método, aquele instante da descoberta é frustrante e a única coisa que queremos saber é o que causou o problema.

Em geral procuramos por erros grandes para justificar o problema: uma coluna saturada, uma fase móvel preparada errada ou um defeito no equipamento.

Mas na maioria das vezes não encontramos o tal “problema”, e dependendo do nível de compliance da empresa em que você atua, alguns dias serão perdidos tentando justificar o erro, sem encontrar o real motivo para o problema.

O que muitos usuários de cromatografia líquida ainda não perceberam é que em geral, este “problema” grande que estamos procurando nada mais é do que a somatória de pequenos erros gerados na nossa rotina de preparação do sistema HPLC para aquela análise.

Nos próximos posts iremos tratar em detalhes quais são os cuidados que os cromatografistas experientes utilizam em sua rotina para garantir uma rotina produtiva e confiável.

Qualidade dos solvents / reagentes: a pureza dos solventes e reagentes utilizados em análises por HPLC / UHPLC é de extrema importância. Reagentes e solvents grau HPLC são mais caros, mas a diferença no grau de pureza quando comparado aos de grau P.A. é importante para o resultado final de sua análise.

Impurezas orgânicas mais apolares tendem a ficar retidas na coluna de fase reversa e dependendo da composição de fase móvel, isso pode se acumular na cabeça da coluna cromatográfica, causando aumento da pressão de trabalho. Se esse contaminante conseguir se deslocar na coluna durante uma análise isocrática, um ruído de linha da base pode ser observado. Se este mesmo tipo de contaminante estiver presente numa análise por gradiente, teremos o aparecimento de picos fantasmas, pois no início do gradiente a força do solvente é menor e o contaminante ficará retido na cabeça da coluna; mas com o aumento da força de solvente durante a separação por gradiente o contaminante sairá possivelmente na forma de um pico.

Impurezas metálicas podem complexar dentro da coluna e alterar de forma decisiva a interação entre suas moléculas e a fase estacionária.

A qualidade da água é outro ponto fundamental nesta equação, pois a água de má qualidade irá trazer inúmeras impurezas para sua análise, por isso a água grau HPLC é mandatória. Por outro lado, a água grau HPLC fica suscetível ao crescimento microbiano, outra fonte de contaminação.

Não se esqueça de considerar também o grau de pureza dos sais utilizados no tampão, pois estes são fontes consideráveis de impurezas da análise cromatográfica.

Outras considerações importantes:

-mantenha frascos de fase móvel fechados para evitar a contaminação;

-utilize frascos âmbar para água e tampões, para minimizer o crescimento microbiano;

-água grau HPLC e tampões devem ser trocados com frequência, devido ao crescimento microbiano;

-evite o uso de frascos plásticos para fase móvel, pois aditivos adicionados ao plástico podem contaminar sua fase móvel.