Análise de aminoácidos – Visão Geral
As análises de aminoácidos envolvem as metodologias utilizadas para determinar a composição ou conteúdo de aminoácidos de proteínas, peptídeos, e outras preparações farmacêuticas. A análise de aminoácidos é muito utilizada em laboratórios de análises clínicas, bioquímicas e indústria de processamento de alimentos. Ela tem sido estudada durante os últimos 30 anos, diversos métodos foram desenvolvidos e tem sido utilizados, cada qual com características próprias, vantagens e desvantagens que se aplicam a cada grupo de interesses específicos. Proteínas e Peptídeos são macromoléculas formadas por aminoácios covalentemente ligados e organizados como um polímero linear. A sequência de aminoácidos nas proteínas ou peptídeos determina as propriedades da molécula. As proteínas são consideradas moléculas grandes, enquanto os peptídeos são menores e contituídos por poucos aminoácidos. As análises de aminoácidos podem ser utilizadas para quantificar proteínas e peptídeos, para identificar proteínas e peptídeos baseado em sua composição de aminoácidos, para análise estrutural de proteínas e peptídeos, para avaliar estratégias de fragmentação para mapeamento de peptídeos, e para identificar aminoácidos atípicos que podem estar presentes numa proteína ou peptídeo. É necessário hidrolisar uma proteína/peptídeo antes de realizar a análise de aminoácidos. Após a hidrólise, os procedimentos da análise de aminoácidos podem ser os mesmos utilizados para aminoácidos livres em outras preparações farmacêuticas. Os aminoácidos constituintes da amostra são tipicamente derivatizados para a análise. O objetivo da derivatização é aumentar a sensibilidade de detecção e a seletividade da separação. Como o número de aminoácidos de interesse é grande e possuem estruturas químicas muito semelhantes, é necessário a utilização de gradiente de fase móvel (normalmente composta por tampão fosfato e acetonitrila).
Um parâmetro limitante que permanece no desenvolvimento da análise de aminoácidos é a confiança na preparação dos hidrolisados protéicos para o método cromatográfico, principalmente quanto à eliminação dos reagentes da hidrólise. A neutralização ou evaporação dos agentes hidrolíticos é importante fator de discussão. O alto teor de sal resultante da neutralização, levado para a coluna de troca iônica, produz alargamento dos picos e não pode ser aplicado a todas as resinas, enquanto que a evaporação até a secagem pode acarretar perdas na recuperação dos aminoácidos durante esse procedimento. O método mais comumente empregado para a eliminação dos reagentes da hidrólise é o da utilização de evaporadores rotativos sob vácuo. Entretanto, para grandes quantidades de amostras torna-se um ponto crítico, pela morosidade e necessidade de acompanhamento contínuo, transformando-se em condição de estrangulamento e demora na análise.
Para diminuir o tempo na evaporação de amostras foram propostos procedimentos utilizando sistemas de evaporação para várias amostras simultâneas. Um tratamento alternativo, utilizado em muitos laboratórios, baseia-se na remoção dos reagentes em dessecadores ou câmaras a vácuo em presença de pastilhas de hidróxido de sódio e/ou pentóxido de fósforo.Os métodos utilizados para análise de aminoácidos são usualmente baseados na técnica de separação cromatográfica de aminoácidos presentes na amostra. As técnicas atuais de análise levam vantagem devido aos excelentes níveis de automatização dos equipamentos de HPLC. A análise de aminoácidos necessita normalmente de HPLC’s capazes de gerar gradientes de fase móvel para separar os aminoácidos na coluna cromatográfica. O instrumento deve ter sistema de derivatização póscoluna, ao menos se a amostra for analisada utilizando derivatização précoluna. O detector comumente utilizado é um UV-Vis ou Fluorescência dependendo do método de derivatização utilizado. Um dispositivo de registro faz-se necessário, como por exemplo um registrador ou software para transformar o sinal do detector e para quantificação. É recomendado também dedicar o equipamento somente para análise de aminoácidos.
Fonte: Farmacopéia Japonesa, artigos internacionais e nacionais.
