Os 10 maiores mitos sobre colunas de HPLC - Parte 2

Mito 3:



"Coluna de Guarda não afeta a separação"


Falso. Primeiro de tudo, utilizar coluna de guarda é uma boa idéia. No entanto, a escolha errada do tipo de coluna de guarda pode ter um grande efeito sobre a separação cromatográfica. Lembre-se que o objetivo de uma coluna de guarda é proteger a coluna analítica de partículas fortemente incrustantes dos componentes da amostra, e outros materiais particulados indesejáveis. A coluna de guarda é muito mais barata do que a coluna analítica, podendo ser substituída com mais freqüência. Idealmente, a coluna de guarda escolhida deve ter exatamente o mesmo recheio utilizado na fase estacionária (coluna analítica). Se a fase estacionária possui maior capacidade de retenção (por exemplo, tem uma maior carga de carbono), então a coluna de guarda pode afetar a separação de um modo prejudicial, causando variação no tempo de retenção ou mesmo diferenças de seletividade. Se a fase estacionária possuir menor capacidade de retenção, a coluna de guarda pode ou não causar problemas, dependendo diretamente do tipo de fase móvel. Para que a coluna de guarda tenha o mínimo de impacto sobre o desempenho da separação, ela deve ser adequadamente inserida no sistema cromatográfico. Obviamente, a coluna de guarda é colocada entre o injetor e a coluna analítica, mas se adicionarmos muita tubulação (seja muito longa ou diâmetro interno maior), alargamento de banda pode ocorrer e afetar a separação entre os picos. Atualmente existem modelos de colunas que integram ou facilitam a colocação de colunas de guarda, evitando o problema citado acima. Essas colunas possuem um tipo de cartucho ou suporte onde a coluna de guarda é adicionada ao sistema com a adição mínima de tubulação, o que torna esse sistema ideal. Seja qual for a configuração utilizada, a coluna de guarda deve ser colocada ou retirada do sistema sem afetar o funcionamento do HPLC. Teoricamente, a coluna de guarda é um acréscimo de fase estacionária no sistema, o que aumentaria os pratos teóricos e consequentemente a resolução cromatográfica. No entanto, por causa de alguns dos fatores discutidos anteriormente, muitas vezes, a adição de uma coluna de guarda só mantém a separação, na melhor das hipóteses, e por vezes deprecia a partir dele, na pior das hipóteses. A vantagem da coluna de guarda está no aumento de vida útil da coluna analítica e não necessariamente aumentar a eficiência global do sistema cromatográfico.





Mito 4:



"Altas temperaturas sempre levam a melhor separações"


Falso. Como a temperatura aumenta, a viscosidade da fase móvel diminui, portanto, a taxa de transferência de massa do soluto deve aumentar, assim, oferecendo uma melhor eficiência cromatográfica. Verdade, mas além do termo eficiência da coluna , temperatura também pode afetar o fator de retenção e a selectividade. O impacto sobre estes termos podem resultar em melhor resolução (que é isso que estamos preocupados na cromatografia) ou diminuí-la. A retenção geralmente diminui à medida que a temperatura aumenta porque, sendo um parâmetro termodinâmico, o analito prefere ficar na fase móvel e consequentemente é eluído mais cedo dentro da coluna. No entanto, diferentes espécies químicas podem possuir diferentes graus de alteração na sua retenção com a variação da temperatura. Além disso, altas temperaturas podem causar uma baixa seletividade e picos podem ser eluídos perto ou sobre o T0 (volume morto), o que pode dificultar a quantificação destes picos. Tomemos como exemplo a figura 1. Esta série de cromatogramas mostra a separação de sete analgésicos com variação da temperatura de coluna de 20 à 90 ° C.





Pode-se notar várias diferenças entre os cromatogramas. Em primeiro lugar, a retenção de todos os picos é diminuída com temperaturas mais elevadas e os picos que se tornam mais estreito indicam o aumento da eficiência. Segundo, um dos analgésicos, o ácido salicílico, sofre maior variação do tempo de retenção com a temperatura do que os picos 5 e 6. De fato, a ordem dos picos é invertida após a mudança de temperatura de 20 para 40 ° C. Na injeção com temperatura de 30 ° C, o ácido salicílico e o pico de número 6, fenacetina, são coeluídos. Portanto, neste exemplo, temperaturas superiores a 40 ° C resultam em um tempo mais curto de corrida e ainda uma alteração na ordem dos picos se comparado com injeções com temperatura mais baixas. Além disso, uma vantagem em operar com temperaturas mais elevadas é a diminuição da pressão de trabalho da coluna, que permite o uso de fluxos mais altos ou partículas menores. Outro parâmetro experimental que pode causar problemas de performance da coluna é a grande diferença de temperatura entre coluna e fase móvel. Por exemplo, se a coluna é aquecida a 60 ° C e o solvente esteja à temperatura ambiente, esta variação (delta) de temperatura pode causar distorções de picos devido ao choque térmico sofrido parte inicial da coluna. É recomendado que se pré-aqueça a fase móvel quando se utilizar temperaturas muito elevadas na coluna.



fonte: http://chromatographyonline.findpharma.com/