Somente 3 coisas - Parte 2

Filtração

A menos que sejam tomadas precauções especiais, todas as partículas que entram no sistema HPLC acabam terminando do frit da coluna, eventualmente entupindo a coluna, aumentando a pressão do sistema, e distorcendo picos no cromatograma. Todos os esforços feitos para reduzir a quantidade de partículas inseridas no sistema serão recompensados com o aumento da confiabilidade durante a realização de análises. Existem três grandes fontes de partículas em HPLC: a fase móvel, a amostra e o desgaste dos componentes internos do equipamento.
Se a fase móvel é composta apenas por solventes grau HPLC, não é necessário para filtrar a fase móvel. Isso porque os solventes orgânicos, como acetonitrila ou metanol, são filtradas em membranas 0,2 μm de porosidade durante o processo de fabricação. Da mesma forma, se você comprar água para HPLC ou gerá-la em laboratório com um sistema de purificação, a última etapa de filtração é através de um filtro de 0,2 μm. No entanto, se houver algum aditivo que outrora fora sólido, tais como tampão fosfato, a filtragem da fase móvel é um passo sensato a se tomar. Apesar do sal para tampão poder ser de alta pureza, ele pode não ter se dissolvido completamente, deixando partículas na fase móvel. Qualquer material particulado na fase móvel também pode causar bloqueio das check valves, causando travamento total ou parcial da mesma. Filtragem da fase móvel através de membrana de 0,45 μm é uma forma eficaz para remover quaisquer partículas da fase móvel. Filtros o,2 um podem ser utilizados, mas eles não são muito mais eficazes que 0,45 μm exigidos para esta aplicação e eles filtram muito mais lentamente. Alguns laboratórios escrevem seu POP de Preparação de fase móvel para HPLC determinando que apenas fases móveis preparadas com solventes HPLC (isso inclui água grau HPLC) não precisam ser filtradas, enquanto todas as outras composições de fase móvel exigem filtração antes do uso. Também é importante usar um filtro de linha no reservatório de fase móvel. Este filtro tipicamente têm porosidade de 10 μm, por isso não é um substituto da filtração de fase móvel, mas serve para manter a poeira fora do sistema e também segura a tubulação no fundo do reservatório, trazendo maior confiabilidade operacional.
A amostra é uma segunda fonte de partículas no sistema HPLC. Alguns laboratórios filtram todas as suas amostras em membranas de 0,5 μm antes de colocá-las carrosel do amostrador automático. Esta é uma forma eficaz de eliminar partículas relativas à amostra, mas existe algumas preocupações sobre este processo que podem pesar na decisão do uso deste procedimento. Primeiro, é muito caro - US$ 1 ou mais por filtro - o que pode aumentar significativamente o custo da análise. Além disso, em um método validado, é necessário validar o processo de filtração e usar filtros para cada amostra, e não apenas para as amostras que você acha que precisam de filtração. Você nunca vai conseguir 100% da amostra através do filtro - sempre há poucos microlitros que ficam para atrás. Existe alguma perda do analito por adsorção no filtro ou contaminação por resíduos do próprio filtro? Se houver perda, é a mesma concentração em todas as amostras? Se é para ser usado filtração, todas estas questões devem ser abordadas durante o processo de validação, que pode aumentar o trabalho e as despesas do processo de validação. Um processo de substituição da filtração e que apresenta a mesma eficácia para a maioria das amostras, é centrifugar a amostra em uma centrífuga de bancada por alguns minutos para assentar no fundo qualquer partícula, e depois transferir o sobrenadante para o carrosel de amostras do amostrador automático.
A última grande fonte de partículas em sistemas HPLC é desgaste do sistema de selos de bomba e de rotores, selos e válvulas de injeção. Selos de bomba geralmente irão durar de seis meses à um ano em laboratórios com o uso normal dos sistemas. É indicado substituir estes em manutenções preventivas semestrais ou anuais. O custo é baixo comparado com o gasto de uma coluna entupida por partículas dos selos de bomba. Algumas bombas têm filtros no caminho para reter partículas resultantes do desgaste da bomba, para garantir que essas partículas não vão parar nos pontos mais estreitos do caminho fluídico. Consulte o manual de operação da bomba para encontrar o intervalo recomendado de limpeza ou substituição desses filtros. Selos de injeção também se desgastam ao longo do tempo e precisam ser substituídos. Já válvulas e rotores de injeção demoram mais tempo para apresentarem problemas. Um injetor que trabalha com rotor normalmente dura entre 10000 e 20000 injeções, o que é um número satisfatório mesmo pros laboratórios com rotinas intensas de análise. Evidentemente, o desgaste de selos de bomba e partes do injetor vai aumentar com a presença de mais abrasivo na fase móve. Assim, se você executa rotineiramente gradientes de troca iônica ou uso contínuo de tampões,é esperado que os selos se desgastem mais rapidamente do que se você usar condições de fase reversa (fase móvel de ACN:H2O por exemplo).
Não importa qual fonte de partículas eu estou tentando eliminar, eu sempre uso um filtro de linha de 0,5 μm entre o injetor automático e a coluna, mesmo que uma coluna de guarda esteja sendo utilizada. Este filtro de linha irá entupir no lugar do frit de 2 μm da cabeça da coluna, e pode ser substituído em poucos minutos, com baixo custo. Basta verificar a pressão do sistema cromatográfico no início de cada sequência de amostras. Quando a pressão do sistema aumenta 25% ou cerca de 500 psi, substitua o filtro de linha e volte ao serviço em poucos minutos.