Perguntas e Respostas sobre
Cromatografia Líquida
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P: Como as novas tecnologias de coluna, como endcapped, novos tipos de empacotamento,
entre outros, se refletem nas aplicações do dia-a-dia ?
R: A tecnologia presente atualmente nas colunas cromatográfica inclui a preparação
do material para empacotamento, proteção das terminações da base estruturante
(endcapping), etc. Nem é preciso dizer que a tecnologia de empacotamento tem
uma influência decisiva no desempenho de separação e na seletividade da coluna
cromatográfica; além disso a diferença de densidade da fase ligada do
empacotamento cromatográfico também afetará quanto de silanol fica exposto na
superfície do material empacotado, influenciando diretamente na seletividade da
coluna. A tecnologia de endcapping utiliza reagentes que diminuem o número de
silanóis expostos na superfície do material empacotado, causando grande impacto
nas propriedades químicas da coluna cromatográfica, como aumento da faixa de
tolerância de pH, melhor tolerância com fases aquosas, diferente polaridade,
etc. A tecnologia de empacotamento de uma coluna não é tão simples quanto se
imagina. Diferentes fases estacionárias, diferentes diâmetros de partícula,
diferentes diâmetros internos e comprimentos da coluna apresentam diferentes técnicas de empacotamento.
Formar um leito empacotado de coluna compacto, estável e uniforme requer muita
experiência.
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P: Em que circunstâncias o frit da coluna precisa ser substituído ? A
substituição do frit reduzirá a vida útil da coluna cromatográfica?
R:
Se o frit da coluna cromatográfica ou o leito empacotado na ponta da coluna
estiverem contaminados pela amostra, é necessário substituir o frit e parte do
recheio do empacotamento da coluna. A Welch Materials Inc não recomenda que os
clientes desmontem os parafusos da cabeça da coluna por conta própria. É melhor
enviá-los de volta ao fabricante para manutenção. A substituição do frit e do
recheio da cabeça da coluna cromatográfica não afetará a vida útil da coluna
HPLC.
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P: Se a coluna for retirada de uso e ficar inativa por muito tempo, que cuidados precisam ser tomados ?
R: Para uma coluna comum de fase reversa, após a lavagem, condicione a
mesma em metanol puro (ou acetonitrila) ou cerca de 80:20 de MeOH:ACN, em
seguida, tampe as duas extremidades da coluna com os conectores cegos para
evitar a volatilização do solvente de preservação. Quando for retomar o uso da
coluna, reative a mesma seguindo o manual da coluna antes do próximo uso.
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P: É indicado o uso de coluna de guarda em meus experimentos ?
R: O uso de coluna de guarda certamente ajudará você a proteger a sua
coluna analítica de entupimentos por algum material particulado. Se a coluna de
guarda estiver bem conectada, for compatível e substituída com frequência, isso
não afetará a separação e a eficiência da coluna analítica. Tenha cuidado ao
escolher o cartucho da coluna de guarda; escolha um cartucho que seja compatível
com o material da coluna analítica, caso contrário, é muito provável que isso afete
a análise dos seus compostos de interesse.
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P: Uma bomba quaternária é usada nas seguintes condições: A: 50% de
metanol; B: 50% de água. Por que muitas vezes o sistema para ou entra bolhas?
R: A proporção H2O:MeOH 55:45 apresenta os valores mais altos para pressão
e viscosidade na coluna. A proporção 50:50 está bem próximo desse valor extremo
e a pressão da coluna é relativamente alta. Mas a maior influência na pressão
da coluna é o tamanho da partícula do material empacotado e o diâmetro interno
da coluna cromatográfica. O filtro de entrada da bomba não consegue manter o
suprimento de fase móvel necessária, criando diferença de pressão e aumentando
a possibilidade de formação de bolhas. O desligamento do sistema também pode
ocorrer pois muitos equipamentos monitoram a variação de pressão da bomba,
variação esta que aumenta muito quando uma bolha entra no sistema pressurizado
de bombas. Considere substituir o filtro de entrada da bomba por filtros de
maior fluxo.
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P: Você pode dar uma breve descrição dos quatro métodos de enchimento /
empacotamento de colunas para cromatografia líquida ?
R: Os dados mostram que em condições normais, quando o tamanho da partícula
de enchimento é > 20 µm, o método de enchimento / empacotamento de coluna
seco é mais apropriado; quando as partículas são menores que 20 µm, o
empacotamento úmido é o ideal. Geralmente, existem quatro métodos de empacotamento:
① O método de homogeneização em alta pressão é usado
principalmente para o empacotamento de colunas analíticas e colunas de preparação
de pequena escala;
② Método de pressão radial;
③ O método de compressão axial é usado principalmente para
empacotar colunas de grande diâmetro, como as colunas DAC (colunas de
compressão axial dinâmica);
④ O empacotamento de coluna à seco é altamente técnico e a
maioria dos laboratórios fabricantes utilizam esse método para colunas
comerciais.
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P: Se eu usar conectores / parafusos de PEEK ao invés de conectores de aço
inoxidável, eu consigo resolver completamente os problemas de compatibilidade
das conexões entre os diferentes fabricantes ?
R: A maioria dos conectores de coluna não são produzidos pelos próprios
fabricantes de coluna. Existem muitos fornecedores, como Valco, Parker, etc.
que fornecem para os grandes fabricantes de cromatógrafos líquidos e colunas.
As medidas não são unificadas entre estes fornecedores, o que causa muitos
problemas de padronização. Com o uso de novas tecnologias, como tubulações e
conectores em PEEK, se torna mais fácil a solução destas incompatibilidades,
evitando vazamentos, formação de volume morto, etc.
P: Ao analisar drogas polipeptídicas (fase móvel A: solução aquosa de TFA
0,1% ou 1%, fase móvel B: solução de acetonitrila TFA 0,1% ou 1%), a flutuação
da linha de base é grande, mas rodando esta análise sem TFA eu tenho uma boa
linha de base, porém não consigo ver meus picos de interesse.
R: Esta flutuação da linha de base é claramente causada pela adição de TFA
à fase móvel e ao gradiente. O TFA é superior a outros modificadores iônicos
porque é volátil e pode ser facilmente removido das amostras preparadas. Por
outro lado, o pico máximo de absorção UV de TFA é inferior a 200 nm, portanto,
é propenso a interferência de linha de base em comprimentos de onda baixos. As
causas para este problemas são muitas mas uma solução mais prática é o uso de
outro modificador de fase móvel.
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P: Como limpar a coluna após usar a fase móvel contendo TFA?
R: O uso de TFA como um reagente de pareamento iônico na separação de
peptídeos e proteínas por cromatografia de fase reversa é um método comum. O
TFA na fase móvel interage com a fase ligada hidrofóbica e com grupos polares
residuais na superfície de várias maneiras para melhorar o formato do pico e
superar os problemas de alargamento e cauda do pico. Como o TFA também é um
reagente de pareamento iônico, é melhor também limpar a coluna usando o
procedimento de limpeza de colunas indicado para este tipo de modificador, ou
seja, retrolavar a coluna com MeOH: H2O (50:50) durante a noite em uma taxa de
fluxo baixa. Para analisar amostras proteicas, é recomendado o retrolavagem
durante a noite em fluxo baixo (10 % do fluxo de trabalho) com uma solução
MeOH-ACN / H2O / TFA (50 / 50 / 0,1).
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P: De acordo com a farmacopéia, o tamanho dos poros dos materiais de
empacotamento da coluna é 300Å para amostras com peso molecular maior que
2.000. Qual será a diferença de resultados analíticos entre 300Å e 100Å de
tamaho de poro ?
R: Ao analisar amostras de polipeptídeos, o tamanho de poro de 300Å do
material empacotado certamente terá uma seletividade melhor do que o tamanho de
poro de 100Å, ou seja, o grau de separação será bom. Como o peso molecular da
proteína é > 2.000, será difícil entrar no poro do empacotamento de 120Å,
então não há retenção, o analito permanece apenas na superfície do
empacotamento e sai com o solvente. Ao escolher sua coluna, geralmente exigimos
que o tamanho do poro seja pelo menos três vezes o diâmetro molecular para
garantir que as moléculas possam entrar no poro.
