Perguntas
e Respostas sobre Cromatografia Líquida
1
P:
Quais são as vantagens da
Cromatografia Líquida (LC) sobre a Cromatografia Gasosa (GC) ?
R: A Cromatografia Líquida apresenta algumas vantagens com relação a
Cromatografia Gasosa, pois tem uma faixa de aplicação muito mais ampla. A
Cromatografia Gasosa, de maneira geral, se limita apenas a analisar substâncias
de baixo peso molecular que são facilmente vaporizadas e visa principalmente as
matérias-primas químicas fundamentais. Mas qualquer substância solúvel em
solvente, variando de dezenas a centenas de milhares de unidades de peso
molecular, podem ser analisadas por Cromatografia Líquida. Em produtos
farmacêuticos, químicos, proteção ambiental, alimentos e muitos outros campos
importantes, a Cromatografia Líquida se tornou uma ferramenta analítica líder.
Existem também algumas circunstâncias em que ambas as técnicas podem ser
aplicadas, mas a preparação da amostra para LC é mais simples. O surgimento da
Cromatografia Líquida compensou falhas da técnica de GC a A aparência do LC
compensa o defeito de que o GC, como não poder ser usado diretamente para
analisar compostos voláteis ou na análise de compostos termolábeis e polímeros.
2
P:
Os analistas de laboratório
costumam duvidar se a coluna cromatográfica de LC pode ser limpa utilizando a
técnica de retrolavagem ( em Inglês, backflush -quando a limpeza da coluna e
feita invertendo o sentido do fluxo). Que tipo de coluna pode ser limpa
utilizando esta técnica ? E qual coluna não pode? Após a retrolavagem, a coluna
deve ser usada na direção normal?
R: Geralmente, as colunas de fase
normal e de fase reversa podem ser limpas por retrolavagem. Mas a retrolavagem
não pode ser usada em colunas que apresentam frita de entrada e saída com
tamanho de poro assimétrico, colunas fabricadas desta maneira são incomuns nos
dias atuais. A retrolavagem visa retirar os contaminantes da coluna de maneria
fácil e rápida, por isso é melhor usar a coluna na direção normal para evitar
contaminação em ambas as extremidades. A maioria das colunas Welch podem ser limpas
por retrolavagem, e recomendamos o uso de colunas na direção normal e a limpeza
na direção oposta.
3
P: Alguns fabricantes usam um tamanho
de poro maior (2 ~ 5 μm) na frita de entrada para evitar o entupimento, com
isso a retrolavagem irá remover material do leito empacotado. O tamanho dos
poros das fritas de entrada e saída serão informados nas instruções de uso da
coluna ?
R: Se o tamanho dos poros das fritas de
entrada e saída da coluna forem assimétricos, o fabricante certamente o
mencionará nas instruções. O tamanho dos poros das fritas de entrada e saída das
colunas Welch é simétrico.
4
P: A coluna deve ser conectada ao
detector durante o retrolavagem?
R: O retrolavagem significa conectar a
coluna ao sistema na direção oposta. Teoricamente, a coluna pode estar
conectada ou desconectada do detector. No entanto, durante a retrolavagem, todo
o material particulado retido pela frita da coluna irá se movimentar no caminho
fluídico e caso o detector esteja conectado, corre-se o risco aumentado de
entupimento de partes sensíveis do detector. Por esta razão, é recomendado não
conectar o detector durante a retrolavagem e colocar a tubulação de saída da
coluna diretamente no seu descarte de solventes.
5
P: Ao usar a coluna de troca iônica
para fazer o desenvolvimento analítico de uma metodologia, e acetonitrila (ACN)
e água como fase móvel, verificou-se que RT (tempo de retenção) é de 2,5
minutos com 60% de ACN e o RT permanece o mesmo com 30% ou 40% de ACN; mas o RT
repentinamente muda para cerca de 13 minutos com 20% de ACN durante o processo
de ajuste do gradiente. Qual é o motivo?
R: O mecanismo de retenção das colunas
de troca iônica é principalmente a interação eletrostática. Os principais
fatores de influência incluem força iônica, pH, interação secundária de
ligações de hidrogênio e exclusão molecular. Portanto, na cromatografia de
troca iônica, o mecanismo de retenção não é tão simples quanto a cromatografia
de fase reversa, nem sua atuação é clara somente alterando a proporção da fase
orgânica. É necessário considerar se o aumento da proporção de fase aquosa leva
à mudança da força iônica da fase móvel ou aumenta as interações das pontes de
hidrogênio. Além disso, se a matriz da coluna de troca iônica é sílica gel ou
polimérica, temos também tem efeitos diferentes.
6
P: Para uma coluna C18 usada em minha
rotina, como ativar e manter esta nova coluna? Por que eu deveria ativar uma
coluna nova ?
R: A ativação da nova coluna é na
verdade um processo de equilíbrio. Durante o transporte e armazenamento da
coluna, o solvente na coluna pode volatilizar, resultando em um leito
empacotado seco. Como a fase ligada não está totalmente “molhada”, a coluna
precisa ser ativada. As colunas Welch podem ser ativadas de acordo com as
instruções. Além de equilibrar com a fase móvel, às vezes é necessário equilibrar
a nova coluna com as amostras testadas. O método de equilíbrio específico
também é muito simples, basta aumentar a concentração da amostra injetada ou fazer
múltiplas injeções enquanto a eluição não estiver completa. O objetivo de
equilibrar uma nova coluna é saturar a capacidade de adsorção dos sítios ativos
presentes na superfície do leito empacotado de sílica com adsorção não
específica.
7
P: A coluna C18 será ativada com
metanol utilizando fluxos baixos. Qual é o propósito disso?
R: A coluna C18 será ativada com
metanol utilizando fluxos baixos, pois a solução de armazenamento pode
volatilizar no processo de armazenamento e transporte. A baixa taxa de fluxo de
metanol pode infiltrar-se bem na fase estacionária, fazendo com que a fase
ligada se estique bem. Depois de equilibrar o sistema com solvente, o
cromatograma pode ser obtido mais rapidamente por múltiplas injeções ou
aumentando o volume da injeção. Desta forma, os sítios ativos na coluna podem
saturar com amostras para evitar fenômenos anormais.
8
P: Eu tinha acabado de instalar uma
nova coluna C18 outro dia e lavei com metanol 100% por mais de meia hora antes
da injeção. Se eu só lavar meia hora e começar a usar, tudo bem? Isso afetará o
pico?
R: Em primeiro lugar, se for apenas a
ativação de uma nova coluna, recomenda-se seguir rigorosamente as instruções do
fabricante; em segundo lugar, nem todas as determinações requerem saturação da
coluna nova. No entanto, é um bom hábito injetar várias vezes de acordo com o
método e iniciar a determinação formal após garantir que o tempo de retenção do
pico de interesse esteja estável.
9
P: Quais colunas são geralmente usadas
para a determinação de peptídeos? Se a fase móvel inclui acetonitrila, água e um
pouco de TFA (ácido trifluoracético), ou preciso analisar peptídeos de cadeias
curtas, que coluna devo escolher?
R: Os polipeptídeos com baixo peso
molecular podem geralmente ser determinados por colunas convencionais C18 ou
C8, bem como colunas de troca iônica e colunas hidrofílicas HILIC. Se a fase
móvel contiver aditivos ácidos, como ácido trifluoroacético, é recomendável
usar colunas que resistem a pH baixo, como as colunas da série Ultisil® LP.
10
P: Quando a coluna amino (NH2) entra em
contato com amostras acidificadas, isso pode danificar a coluna. Se a forma do
pico mudar depois de usar a coluna por um curto período de tempo, o que devo
fazer para manter a coluna?
R: Se você usar uma coluna amino (NH2) para
determinar amostras acidificadas, o modo HILIC da coluna amino pode ser usado.
Os ácidos podem protonar grupos funcionais amino ligeiramente carregados
negativamente, resultando em alterações nas propriedades de retenção de alguns
analitos ou diminuição da eficiência da coluna após o uso da coluna por um curto
período de tempo. Sugestão: enxágue a coluna com 5 ~ 10 vezes o volume da
coluna contendo 0,5 ~ 1,0% de NH3 numa solução acetonitrila / água (50/50, depois
disso, lave o excesso de amônia com fase móvel livre de álcali). Um pouco de
amônia, como 0,05%, é recomendado para ser adicionado na fase móvel ao analisar
este tipo de analitos acidificados.
Caso tenha
dúvidas e necessite de maiores informações, entre em contato conosco ou visite
nossas mídias sociais:
Telefone:
(11) 2309-0287
WhatsApp: (11)
97065-1719
Site institucional: http://www.chromastore.com.br/
Loja online: https://loja.chromastore.com.br/
Canal no
YouTube: https://www.youtube.com/channel/UCBva1syjpIx45wiSA3rlBSw?view_as=subscriber
Facebook: https://www.facebook.com/Chromastore-1477110222589551/
