Pergunta: Qual é a forma correta de lavar uma coluna de fase reversa após usar uma fase móvel composta por tampão: orgânico ? Por exemplo, se eu tenho uma fase móvel (60:40) metanol: tampão (25 mM de fosfato), qual é a melhor maneira de lavar a coluna após a utilização?
John Dolan responde: Existem várias maneiras para se lavar uma coluna. A preocupação quando estamos lavando uma coluna utilizada com tampão é que nós não queremos precipitar o sal dentro coluna. Portanto, a maneira mais segura de se livrar do tampão é substituí-lo por água e utilizar a mesma composição de fase móvel para a primeira lavagem. Para o caso acima, devemos começar a lavagem com (60:40) metanol:água durante alguns minutos (pelo menos 5 min num fluxo de 1-2 mL/min) e, em seguida, ir até 100% de metanol (MeOH), para retirar materiais fortemente retidos na coluna. Com MeOH, uma mudança de sua fase móvel tamponada direto para MeOH provavelmente não é uma preocupação muito grande, porque tampões são bastante solúveis em MeOH. Mas se você utilizar acetonitrila (ACN), onde os tampões apresentam solubilidade muito mais baixa, é possível precipitar o tampão, e esta é uma má notícia.
Outra maneira de lavar a coluna é apenas utilizar 100% de água por alguns minutos antes de se mudar para 100% orgânico. Alguns usuários rejeitam esta ideia, em virtude do fenômeno conhecido como "colapso de coluna", onde em presença de 100% de água, esta é forçada a sair dos poros da coluna. Isto pode acontecer, mas o meu palpite é que a maior parte do tampão é retirado antes que isso aconteça. Se após a lavagem com 100% de água você lavar a coluna com um solvente forte (100% orgânica), a coluna será reequilibrada, e não deve haver problema. Esta maneira é simples, e pode ser mais fácil de automatizar num HPLC.
Revisando, a chave para lavagem de uma coluna após o uso de tampão é remover o tampão, de modo que não haja risco de precipitação e, em seguida, lavar com 100% orgânico para remover o material fortemente retido. Se você tiver a infeliz experiência de precipitar o tampão, o melhor é jogar fora a coluna - retirar o tampão precipitado dos poros da coluna é quase impossível.
