Lavagem
A terceira prática fundamental para a operação de HPLC's com confiabilidade é mantê-lo limpo. Se você seguir o caminho através do fluxo do sistema, você notará várias áreas que podem se beneficiar de regular lavagem. Primeiro, os reservatórios de fase móvel devem ser lavados ou trocados com cada novo lote de solvente ou preparação de fase móvel. Um frasco sujo pode contaminar uma fase móvel ou solvente puro. Eu não gosto de usar tampões por mais tempo do que uma semana e solventes orgânicos por mais de um mês sem lavagem do sistema. De preferência, evite o procedimento de encher ou completar o mesmo frasco de solvente ou fase móvel, mas sim crie o hábito de trocar esse frasco toda vez que uma nova fase é preparada ou um frasco de solvente esvaziou. Na sequência vem a bomba. Eu não gosto de desligar uma bomba por mais de alguns minutos se ela contém um tampão não volátil, como o fosfato. Quando evaporar o solvente, como por exemplo ao redor do selo do pistão, material sólido se precipitará e poderá riscar os selos. Este é um dos principais motivos de desgaste prematuro de selos. Se fases móveis tamponadas são deixados no sistema por longos períodos, especialmente se for utilizada acetonitrila, eles podem formar precipitados, que podem causar desgaste de selos e travamento de check-valves. Então, lave a bomba com fase móvel não tamponada antes de desligá-la por períodos prolongados. O injetor automático também deve ser limpo com regularidade. Eu nunca vi um injetor automático que não apresentou vazamentos ou entupimentos. O solvente de lavagem do injetor automático deve ser tratado da mesma forma que a fase móvel, em termos de validade e regular lavagem ou a substituição do reservatório. Contaminantes se acumulam na coluna ao longo do tempo, muitas vezes sendo eluídos e gerando ruído em futuros cromatogramas. Este problema pode ser minimizado com a lavagem da coluna com o solvente forte da fase móvel (por exemplo, metanol ou acetonitrila), no final de cada lote de amostras ou quando a coluna é removida do sistema. Na minha experiência, é mais fácil lavarmos o sistema como indicado acima do que danificar o detector. Por esta razão, cuidar da coluna cromatográfica e manter bons procedimentos de lavagem do sistema evitam problemas de contaminação e entupimentos em células de fluxo dos detectores. Para detectores que trabalham com fase móvel no estado líquido, como os UV's e Fluorescência, somente se houver problemas específicos no detector, como bolhas, sujeira ou entupimento, siga os procedimentos indicados no manual do detector ou chame um especialista. Detectores evaporativos, como os detectores de espalhamento de luz ou detectores de massa a história é diferente. Estes detectores eventualmente criar uma película de contaminantes não volátil e requerem limpeza regularmente.
Resumo: então aí está - desgaseificar, filtrar e lavar. Agora que você recebeu todos os conhecimentos básicos necessários sobre manutenção preventiva. Evidentemente, não é tão simples, mas estas três práticas vão trazer maior confiabilidade no uso e nos resultados de cromatografia do seu laboratório. Boa sorte!
sexta-feira, 19 de dezembro de 2008
terça-feira, 2 de dezembro de 2008
Os 10 maiores mitos sobre colunas de HPLC - Parte 2
Mito 3:
"Coluna de Guarda não afeta a separação"
Falso. Primeiro de tudo, utilizar coluna de guarda é uma boa idéia. No entanto, a escolha errada do tipo de coluna de guarda pode ter um grande efeito sobre a separação cromatográfica. Lembre-se que o objetivo de uma coluna de guarda é proteger a coluna analítica de partículas fortemente incrustantes dos componentes da amostra, e outros materiais particulados indesejáveis. A coluna de guarda é muito mais barata do que a coluna analítica, podendo ser substituída com mais freqüência. Idealmente, a coluna de guarda escolhida deve ter exatamente o mesmo recheio utilizado na fase estacionária (coluna analítica). Se a fase estacionária possui maior capacidade de retenção (por exemplo, tem uma maior carga de carbono), então a coluna de guarda pode afetar a separação de um modo prejudicial, causando variação no tempo de retenção ou mesmo diferenças de seletividade. Se a fase estacionária possuir menor capacidade de retenção, a coluna de guarda pode ou não causar problemas, dependendo diretamente do tipo de fase móvel. Para que a coluna de guarda tenha o mínimo de impacto sobre o desempenho da separação, ela deve ser adequadamente inserida no sistema cromatográfico. Obviamente, a coluna de guarda é colocada entre o injetor e a coluna analítica, mas se adicionarmos muita tubulação (seja muito longa ou diâmetro interno maior), alargamento de banda pode ocorrer e afetar a separação entre os picos. Atualmente existem modelos de colunas que integram ou facilitam a colocação de colunas de guarda, evitando o problema citado acima. Essas colunas possuem um tipo de cartucho ou suporte onde a coluna de guarda é adicionada ao sistema com a adição mínima de tubulação, o que torna esse sistema ideal. Seja qual for a configuração utilizada, a coluna de guarda deve ser colocada ou retirada do sistema sem afetar o funcionamento do HPLC. Teoricamente, a coluna de guarda é um acréscimo de fase estacionária no sistema, o que aumentaria os pratos teóricos e consequentemente a resolução cromatográfica. No entanto, por causa de alguns dos fatores discutidos anteriormente, muitas vezes, a adição de uma coluna de guarda só mantém a separação, na melhor das hipóteses, e por vezes deprecia a partir dele, na pior das hipóteses. A vantagem da coluna de guarda está no aumento de vida útil da coluna analítica e não necessariamente aumentar a eficiência global do sistema cromatográfico.
Mito 4:
"Altas temperaturas sempre levam a melhor separações"
Falso. Como a temperatura aumenta, a viscosidade da fase móvel diminui, portanto, a taxa de transferência de massa do soluto deve aumentar, assim, oferecendo uma melhor eficiência cromatográfica. Verdade, mas além do termo eficiência da coluna , temperatura também pode afetar o fator de retenção e a selectividade. O impacto sobre estes termos podem resultar em melhor resolução (que é isso que estamos preocupados na cromatografia) ou diminuí-la. A retenção geralmente diminui à medida que a temperatura aumenta porque, sendo um parâmetro termodinâmico, o analito prefere ficar na fase móvel e consequentemente é eluído mais cedo dentro da coluna. No entanto, diferentes espécies químicas podem possuir diferentes graus de alteração na sua retenção com a variação da temperatura. Além disso, altas temperaturas podem causar uma baixa seletividade e picos podem ser eluídos perto ou sobre o T0 (volume morto), o que pode dificultar a quantificação destes picos. Tomemos como exemplo a figura 1. Esta série de cromatogramas mostra a separação de sete analgésicos com variação da temperatura de coluna de 20 à 90 ° C.
Pode-se notar várias diferenças entre os cromatogramas. Em primeiro lugar, a retenção de todos os picos é diminuída com temperaturas mais elevadas e os picos que se tornam mais estreito indicam o aumento da eficiência. Segundo, um dos analgésicos, o ácido salicílico, sofre maior variação do tempo de retenção com a temperatura do que os picos 5 e 6. De fato, a ordem dos picos é invertida após a mudança de temperatura de 20 para 40 ° C. Na injeção com temperatura de 30 ° C, o ácido salicílico e o pico de número 6, fenacetina, são coeluídos. Portanto, neste exemplo, temperaturas superiores a 40 ° C resultam em um tempo mais curto de corrida e ainda uma alteração na ordem dos picos se comparado com injeções com temperatura mais baixas. Além disso, uma vantagem em operar com temperaturas mais elevadas é a diminuição da pressão de trabalho da coluna, que permite o uso de fluxos mais altos ou partículas menores. Outro parâmetro experimental que pode causar problemas de performance da coluna é a grande diferença de temperatura entre coluna e fase móvel. Por exemplo, se a coluna é aquecida a 60 ° C e o solvente esteja à temperatura ambiente, esta variação (delta) de temperatura pode causar distorções de picos devido ao choque térmico sofrido parte inicial da coluna. É recomendado que se pré-aqueça a fase móvel quando se utilizar temperaturas muito elevadas na coluna.
fonte: http://chromatographyonline.findpharma.com/
"Coluna de Guarda não afeta a separação"
Falso. Primeiro de tudo, utilizar coluna de guarda é uma boa idéia. No entanto, a escolha errada do tipo de coluna de guarda pode ter um grande efeito sobre a separação cromatográfica. Lembre-se que o objetivo de uma coluna de guarda é proteger a coluna analítica de partículas fortemente incrustantes dos componentes da amostra, e outros materiais particulados indesejáveis. A coluna de guarda é muito mais barata do que a coluna analítica, podendo ser substituída com mais freqüência. Idealmente, a coluna de guarda escolhida deve ter exatamente o mesmo recheio utilizado na fase estacionária (coluna analítica). Se a fase estacionária possui maior capacidade de retenção (por exemplo, tem uma maior carga de carbono), então a coluna de guarda pode afetar a separação de um modo prejudicial, causando variação no tempo de retenção ou mesmo diferenças de seletividade. Se a fase estacionária possuir menor capacidade de retenção, a coluna de guarda pode ou não causar problemas, dependendo diretamente do tipo de fase móvel. Para que a coluna de guarda tenha o mínimo de impacto sobre o desempenho da separação, ela deve ser adequadamente inserida no sistema cromatográfico. Obviamente, a coluna de guarda é colocada entre o injetor e a coluna analítica, mas se adicionarmos muita tubulação (seja muito longa ou diâmetro interno maior), alargamento de banda pode ocorrer e afetar a separação entre os picos. Atualmente existem modelos de colunas que integram ou facilitam a colocação de colunas de guarda, evitando o problema citado acima. Essas colunas possuem um tipo de cartucho ou suporte onde a coluna de guarda é adicionada ao sistema com a adição mínima de tubulação, o que torna esse sistema ideal. Seja qual for a configuração utilizada, a coluna de guarda deve ser colocada ou retirada do sistema sem afetar o funcionamento do HPLC. Teoricamente, a coluna de guarda é um acréscimo de fase estacionária no sistema, o que aumentaria os pratos teóricos e consequentemente a resolução cromatográfica. No entanto, por causa de alguns dos fatores discutidos anteriormente, muitas vezes, a adição de uma coluna de guarda só mantém a separação, na melhor das hipóteses, e por vezes deprecia a partir dele, na pior das hipóteses. A vantagem da coluna de guarda está no aumento de vida útil da coluna analítica e não necessariamente aumentar a eficiência global do sistema cromatográfico.
Mito 4:
"Altas temperaturas sempre levam a melhor separações"
Falso. Como a temperatura aumenta, a viscosidade da fase móvel diminui, portanto, a taxa de transferência de massa do soluto deve aumentar, assim, oferecendo uma melhor eficiência cromatográfica. Verdade, mas além do termo eficiência da coluna , temperatura também pode afetar o fator de retenção e a selectividade. O impacto sobre estes termos podem resultar em melhor resolução (que é isso que estamos preocupados na cromatografia) ou diminuí-la. A retenção geralmente diminui à medida que a temperatura aumenta porque, sendo um parâmetro termodinâmico, o analito prefere ficar na fase móvel e consequentemente é eluído mais cedo dentro da coluna. No entanto, diferentes espécies químicas podem possuir diferentes graus de alteração na sua retenção com a variação da temperatura. Além disso, altas temperaturas podem causar uma baixa seletividade e picos podem ser eluídos perto ou sobre o T0 (volume morto), o que pode dificultar a quantificação destes picos. Tomemos como exemplo a figura 1. Esta série de cromatogramas mostra a separação de sete analgésicos com variação da temperatura de coluna de 20 à 90 ° C.
Pode-se notar várias diferenças entre os cromatogramas. Em primeiro lugar, a retenção de todos os picos é diminuída com temperaturas mais elevadas e os picos que se tornam mais estreito indicam o aumento da eficiência. Segundo, um dos analgésicos, o ácido salicílico, sofre maior variação do tempo de retenção com a temperatura do que os picos 5 e 6. De fato, a ordem dos picos é invertida após a mudança de temperatura de 20 para 40 ° C. Na injeção com temperatura de 30 ° C, o ácido salicílico e o pico de número 6, fenacetina, são coeluídos. Portanto, neste exemplo, temperaturas superiores a 40 ° C resultam em um tempo mais curto de corrida e ainda uma alteração na ordem dos picos se comparado com injeções com temperatura mais baixas. Além disso, uma vantagem em operar com temperaturas mais elevadas é a diminuição da pressão de trabalho da coluna, que permite o uso de fluxos mais altos ou partículas menores. Outro parâmetro experimental que pode causar problemas de performance da coluna é a grande diferença de temperatura entre coluna e fase móvel. Por exemplo, se a coluna é aquecida a 60 ° C e o solvente esteja à temperatura ambiente, esta variação (delta) de temperatura pode causar distorções de picos devido ao choque térmico sofrido parte inicial da coluna. É recomendado que se pré-aqueça a fase móvel quando se utilizar temperaturas muito elevadas na coluna.
fonte: http://chromatographyonline.findpharma.com/
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