Perguntas e Respostas HPLC Parte 3

 

                                              

Artigos Welch / Chromastore   artigo 11FEV22 Traduzido por Ronaldo Buissa Netto

 

Perguntas e Respostas sobre Cromatografia Líquida

Esta é a parte 3 da série de perguntas e respostas sobre Cromatografia Líquida que foi publicada anteriormente. Esta parte abordará mais perguntas e respostas, que o ajudarão a saber mais sobre cromatografia líquida.

 

1

P: Qual solvente é adequado para armazenar colunas de sílica gel utilizadas em cromatografia de fase normal ?

 

R: Não importa se o período de armazenamento é curto ou longo, indicamos o uso de uma fase móvel geralmente composta por n-hexano e uma pequena  quantidade de isopropanol (95:5 /  99:1 /  99,5:0,5).

 

2

P: Por que os tamponamentos com fosfatos diminuem a vida útil da coluna cromatográfica ? Comparado com outros tampões, quanto o uso do tampão fosfato reduz a vida útil da coluna ?

 

R: Em primeiro lugar, precisamos corrigir um mal-entendido. Para colunas cromatográficas, um pH > 6,5 não é um “ambiente neutro” como todos entendem. Quando o pH do sal tampão é superior a 6,5, é um ambiente alcalino para a coluna cromatográfica, por isso é prejudicial à matriz de sílica. Além disso, a molécula de fosfato é pequena, o que facilita sua entrada na fase ligada, resultando na hidrólise destas ligações entre base estruturante de sílica e a fase ligada. Devido às vantagens insubstituíveis do tampão de fosfato, como propriedade estáveis, excelente capacidade de tamponamento, entre outras, este é um dos sais mais utilizados no cromatografia líquida, o que obriga os usuários a aceitarem que uma coluna cromatográfica terá sua vida útil diminuída devido ao uso rotineiro deste sal.

 

3

P: Como os reagentes de pareamento iônico funcionam na cromatografia de fase reversa por pareamento iônico ?

 

R: Em primeiro lugar, a extremidade polar do reagente de pareamento iônico se associa ao íon alvo formando um complexo para reduzir sua polaridade, para que possa ser melhor retido na coluna cromatográfica. Além disso, de acordo com a teoria do efeito hidrofóbico, a extremidade hidrofóbica do reagente de pareamento iônico interage facilmente com a cadeia C18 (ou outro grupo apolar presente na superfície da sílica), por isso é mais fácil conseguir retenção na coluna. Portanto, a ação do reagente de pareamento iônico é um mecanismo de retenção misto, ou seja, a atuação do pareador iônico na formação do complexo entre analito e pareador e a sua atuação “mascarando” os grupos polares presentes no analito. Essas duas ações ocorrem juntas.

 

4

P: Qual é a diferença entre o reagente do pareamento iônico tetrabutilamônio e o alquil sulfonato de sódio ? Por que o tetrabutilamônio tem uma influência tão grande na vida útil da coluna cromatográfica ?

 

R: O tetrabutilamônio como pareador iônico não é tão utilizados quanto os reagentes de pareamento iônico de alquil sulfonato de sódio. A razão é que as substâncias polares ácidas podem facilmente melhorar a capacidade de retenção na cromatografia de fase reversa, reduzindo o valor do pH. A redução do pH pode inibir a ionização do ácido, tornar o ácido em estado neutro e aumentar a interação com a cadeia de carbono hidrofóbica. Os analitos alcalinos são seriamente afetados pelo limite superior do pH da matriz de sílica, e é difícil ajustar o pH da fase móvel para muito alto. Portanto, reagentes de pareamento de cátions são frequentemente adicionados em pH baixo ao analisar compostos alcalinos. Experimentos mostram que os reagentes de pareamento iônico  tetrabutilamônio são mais difíceis de remover da superfície de empacotamento da coluna do que o pareador alquil sulfonato de sódio e outros reagentes de pareamento de cátions, por isso a desgaste intenso e prematuro da vida útil da coluna cromatográfica.

 

5

P: Por que o tempo de retenção muda para a mesma coluna cromatográfica, depois de terminar o Projeto A e depois o Projeto B ? Por que a forma do pico é anormal ? O que vai acontecer ?

 

R: A coluna cromatográfica está contaminada por substâncias de forte retenção, ou seja, após a interação do contaminante com o leito empacotado, o tempo de retenção é adiantado ou atrasado. A identificação do problema depende da natureza do contaminante e da ação conjunta do analito, fase estacionária e contaminante na superfície da coluna, e quanto mais complexa essa interação, mais difícil prever os resultados experimentais futuros. Durante a manutenção de rotina, preste atenção à retrolavagem e a limpeza dos contaminantes com solvente que possa dissolvê-los após a sua análise, de modo a reduzir ou evitar esta situação.

 

6

P: Qual é o objetivo da derivatização pré-coluna por HPLC?

 

R: O método de derivatização química na tecnologia cromatográfica refere-se ao método de separação e detecção após a mudança dos componentes da amostra em derivados correspondentes com reagentes químicos especiais (geralmente referidos como reagentes de derivatização) no processo cromatográfico. O objetivo é: 1. Melhorar a sensibilidade de detecção através da introdução de grupos funcionais de forte absorção no ultravioleta-visível no analito a ser detectado ou adicionando grupos fluorescentes para convertê-los em derivados fluorescentes; 2. Melhorar a separação e seletividade de amostras analíticas.

 

7

P: Quando tenho vários analitos difíceis de separar, como melhorar a separação selecionando a coluna apropriada ?

 

R: Três fatores principais influênciam na separação: eficiência da coluna, seletividade e fator de retenção. A eficiência da coluna pode ser melhorada reduzindo o tamanho de partícula do leito empacotado e aumentando o comprimento da coluna; a seletividade está relacionada com a seleção da fase estacionária e condições de pH. A seletividade pode ser melhorada selecionando a coluna cromatográfica apropriada e pH apropriado; O fator de retenção está relacionado principalmente à composição e proporção da fase móvel; além disso o pH e a força iônica da fase móvel afetam o estado existente do analito de interesse e também afetam o fator de retenção. Às vezes, aumentar o fator de retenção também pode melhorar a separação.

 

8

P: Quando devo considerar o uso de colunas Fenil e colunas Ciano?

 

R: As colunas Fenil tem alta seletividade para a determinação de compostos aromáticos contendo anel benzênico. As colunas CN pode ser usadas como uma coluna de fase reversa com a capacidade de retenção mais fraca ou uma coluna de fase normal com atividade reduzida.

 

9

P: Tenho o mesmo tipo de coluna em diferentes comprimentos e tamanhos de partículas. Como escolher entre elas ?

 

R: O comprimento e o tamanho da partícula são usados ​​para alterar a eficiência da coluna (quanto mais comprida a coluna, mais eficiente; quanto menos o tamanho de partícula, mais eficiente). Quando o número de substâncias a serem separadas é ≤ 5, a coluna cromatográfica com comprimento de coluna de 150 mm pode atender a separação da maioria das amostras.

 

10

P: Uma coluna C18 comum pode ser usada como coluna cromatográfica de fase normal ? Que tipo de coluna cromatográfica é a mais comum e a mais usada na cromatografia de fase normal? O que deve ser observado no uso da coluna de fase normal em comparação com a coluna de fase reversa?

 

R: O modo de separação da cromatografia de fase normal significa que a polaridade da fase estacionária é maior que a da fase móvel. Na cromatografia de fase reversa, a polaridade da fase móvel é maior que da fase estacionária. A fase estacionária C18 é relativamente hidrofóbica. Hidrofobicidade forte significa que a polaridade é muito fraca. Não deve haver fase móvel com polaridade mais fraca do que ela. Além disso, ao usar a coluna cromatográfica, deve-se notar que a fase estacionária polar deve evitar o solvente polar tanto quanto possível, e a fase estacionária não polar deve evitar o solvente não polar o máximo possível, caso contrário, o efeito da “miscibilidade semelhante” pode ocorrer (eluição demorada / longos tempos de retenção).

As colunas de fase normal mais comuns incluem as colunas de sílica, coluna amino, coluna CN e coluna à base Diol. A coluna mais comum deve ser a coluna de sílica gel. A coisa mais importante a se prestar atenção quando utilizando uma coluna de fase normal é com relação a água. A coluna de fase normal é muito sensível à umidade / água. A pequena alteração do teor de umidade / água na fase móvel tem grande influência no tempo de retenção. Portanto, o tempo de equilíbrio de uma coluna de fase normal pode variar de algumas horas ou até mais.

Perguntas e Respostas HPLC - Parte 2

 

Perguntas e Respostas sobre Cromatografia Líquida

1

P: Como as novas tecnologias de coluna, como endcapped, novos tipos de empacotamento, entre outros, se refletem nas aplicações do dia-a-dia ?

R: A tecnologia presente atualmente nas colunas cromatográfica inclui a preparação do material para empacotamento, proteção das terminações da base estruturante (endcapping), etc. Nem é preciso dizer que a tecnologia de empacotamento tem uma influência decisiva no desempenho de separação e na seletividade da coluna cromatográfica; além disso a diferença de densidade da fase ligada do empacotamento cromatográfico também afetará quanto de silanol fica exposto na superfície do material empacotado, influenciando diretamente na seletividade da coluna. A tecnologia de endcapping utiliza reagentes que diminuem o número de silanóis expostos na superfície do material empacotado, causando grande impacto nas propriedades químicas da coluna cromatográfica, como aumento da faixa de tolerância de pH, melhor tolerância com fases aquosas, diferente polaridade, etc. A tecnologia de empacotamento de uma coluna não é tão simples quanto se imagina. Diferentes fases estacionárias, diferentes diâmetros de partícula, diferentes diâmetros internos e comprimentos  da coluna apresentam diferentes técnicas de empacotamento. Formar um leito empacotado de coluna compacto, estável e uniforme requer muita experiência.

 

2

P: Em que circunstâncias o frit da coluna precisa ser substituído ? A substituição do frit reduzirá a vida útil da coluna cromatográfica?

 R: Se o frit da coluna cromatográfica ou o leito empacotado na ponta da coluna estiverem contaminados pela amostra, é necessário substituir o frit e parte do recheio do empacotamento da coluna. A Welch Materials Inc não recomenda que os clientes desmontem os parafusos da cabeça da coluna por conta própria. É melhor enviá-los de volta ao fabricante para manutenção. A substituição do frit e do recheio da cabeça da coluna cromatográfica não afetará a vida útil da coluna HPLC.

 

3

P: Se a coluna for retirada de uso e ficar inativa por muito tempo, que cuidados  precisam ser tomados ?

R: Para uma coluna comum de fase reversa, após a lavagem, condicione a mesma em metanol puro (ou acetonitrila) ou cerca de 80:20 de MeOH:ACN, em seguida, tampe as duas extremidades da coluna com os conectores cegos para evitar a volatilização do solvente de preservação. Quando for retomar o uso da coluna, reative a mesma seguindo o manual da coluna antes do próximo uso.

 

4

P: É indicado o uso de coluna de guarda em meus experimentos ?

R: O uso de coluna de guarda certamente ajudará você a proteger a sua coluna analítica de entupimentos por algum material particulado. Se a coluna de guarda estiver bem conectada, for compatível e substituída com frequência, isso não afetará a separação e a eficiência da coluna analítica. Tenha cuidado ao escolher o cartucho da coluna de guarda; escolha um cartucho que seja compatível com o material da coluna analítica, caso contrário, é muito provável que isso afete a análise dos seus compostos de interesse.

 

5

P: Uma bomba quaternária é usada nas seguintes condições: A: 50% de metanol; B: 50% de água. Por que muitas vezes o sistema para ou entra bolhas?

R: A proporção H2O:MeOH 55:45 apresenta os valores mais altos para pressão e viscosidade na coluna. A proporção 50:50 está bem próximo desse valor extremo e a pressão da coluna é relativamente alta. Mas a maior influência na pressão da coluna é o tamanho da partícula do material empacotado e o diâmetro interno da coluna cromatográfica. O filtro de entrada da bomba não consegue manter o suprimento de fase móvel necessária, criando diferença de pressão e aumentando a possibilidade de formação de bolhas. O desligamento do sistema também pode ocorrer pois muitos equipamentos monitoram a variação de pressão da bomba, variação esta que aumenta muito quando uma bolha entra no sistema pressurizado de bombas. Considere substituir o filtro de entrada da bomba por filtros de maior fluxo.

 

6

P: Você pode dar uma breve descrição dos quatro métodos de enchimento / empacotamento de colunas para cromatografia líquida ?

 

R: Os dados mostram que em condições normais, quando o tamanho da partícula de enchimento é > 20 µm, o método de enchimento / empacotamento de coluna seco é mais apropriado; quando as partículas são menores que 20 µm, o empacotamento úmido é o ideal. Geralmente, existem quatro métodos de empacotamento:

① O método de homogeneização em alta pressão é usado principalmente para o empacotamento de colunas analíticas e colunas de preparação de pequena escala;

② Método de pressão radial;

③ O método de compressão axial é usado principalmente para empacotar colunas de grande diâmetro, como as colunas DAC (colunas de compressão axial dinâmica);

④ O empacotamento de coluna à seco é altamente técnico e a maioria dos laboratórios fabricantes utilizam esse método para colunas comerciais.

 

7

P: Se eu usar conectores / parafusos de PEEK ao invés de conectores de aço inoxidável, eu consigo resolver completamente os problemas de compatibilidade das conexões entre os diferentes fabricantes ?

R: A maioria dos conectores de coluna não são produzidos pelos próprios fabricantes de coluna. Existem muitos fornecedores, como Valco, Parker, etc. que fornecem para os grandes fabricantes de cromatógrafos líquidos e colunas. As medidas não são unificadas entre estes fornecedores, o que causa muitos problemas de padronização. Com o uso de novas tecnologias, como tubulações e conectores em PEEK, se torna mais fácil a solução destas incompatibilidades, evitando vazamentos, formação de volume morto, etc.

 

 8

P: Ao analisar drogas polipeptídicas (fase móvel A: solução aquosa de TFA 0,1% ou 1%, fase móvel B: solução de acetonitrila TFA 0,1% ou 1%), a flutuação da linha de base é grande, mas rodando esta análise sem TFA eu tenho uma boa linha de base, porém não consigo ver meus picos de interesse.

R: Esta flutuação da linha de base é claramente causada pela adição de TFA à fase móvel e ao gradiente. O TFA é superior a outros modificadores iônicos porque é volátil e pode ser facilmente removido das amostras preparadas. Por outro lado, o pico máximo de absorção UV de TFA é inferior a 200 nm, portanto, é propenso a interferência de linha de base em comprimentos de onda baixos. As causas para este problemas são muitas mas uma solução mais prática é o uso de outro modificador de fase móvel.  

 

9

P: Como limpar a coluna após usar a fase móvel contendo TFA?

R: O uso de TFA como um reagente de pareamento iônico na separação de peptídeos e proteínas por cromatografia de fase reversa é um método comum. O TFA na fase móvel interage com a fase ligada hidrofóbica e com grupos polares residuais na superfície de várias maneiras para melhorar o formato do pico e superar os problemas de alargamento e cauda do pico. Como o TFA também é um reagente de pareamento iônico, é melhor também limpar a coluna usando o procedimento de limpeza de colunas indicado para este tipo de modificador, ou seja, retrolavar a coluna com MeOH: H2O (50:50) durante a noite em uma taxa de fluxo baixa. Para analisar amostras proteicas, é recomendado o retrolavagem durante a noite em fluxo baixo (10 % do fluxo de trabalho) com uma solução MeOH-ACN / H2O / TFA (50 / 50 / 0,1).

  

10

P: De acordo com a farmacopéia, o tamanho dos poros dos materiais de empacotamento da coluna é 300Å para amostras com peso molecular maior que 2.000. Qual será a diferença de resultados analíticos entre 300Å e 100Å de tamaho de poro ?

R: Ao analisar amostras de polipeptídeos, o tamanho de poro de 300Å do material empacotado certamente terá uma seletividade melhor do que o tamanho de poro de 100Å, ou seja, o grau de separação será bom. Como o peso molecular da proteína é > 2.000, será difícil entrar no poro do empacotamento de 120Å, então não há retenção, o analito permanece apenas na superfície do empacotamento e sai com o solvente. Ao escolher sua coluna, geralmente exigimos que o tamanho do poro seja pelo menos três vezes o diâmetro molecular para garantir que as moléculas possam entrar no poro.

 

Perguntas e Respostas sobre Cromatografia Líquida

1

 

P: Quais são as vantagens da Cromatografia Líquida (LC) sobre a Cromatografia Gasosa (GC) ?

 

R:  A Cromatografia Líquida apresenta algumas vantagens com relação a Cromatografia Gasosa, pois tem uma faixa de aplicação muito mais ampla. A Cromatografia Gasosa, de maneira geral, se limita apenas a analisar substâncias de baixo peso molecular que são facilmente vaporizadas e visa principalmente as matérias-primas químicas fundamentais. Mas qualquer substância solúvel em solvente, variando de dezenas a centenas de milhares de unidades de peso molecular, podem ser analisadas por Cromatografia Líquida. Em produtos farmacêuticos, químicos, proteção ambiental, alimentos e muitos outros campos importantes, a Cromatografia Líquida se tornou uma ferramenta analítica líder. Existem também algumas circunstâncias em que ambas as técnicas podem ser aplicadas, mas a preparação da amostra para LC é mais simples. O surgimento da Cromatografia Líquida compensou falhas da técnica de GC a A aparência do LC compensa o defeito de que o GC, como não poder ser usado diretamente para analisar compostos voláteis ou na análise de compostos termolábeis e polímeros.

 

2

 

P: Os analistas de laboratório costumam duvidar se a coluna cromatográfica de LC pode ser limpa utilizando a técnica de retrolavagem ( em Inglês, backflush -quando a limpeza da coluna e feita invertendo o sentido do fluxo). Que tipo de coluna pode ser limpa utilizando esta técnica ? E qual coluna não pode? Após a retrolavagem, a coluna deve ser usada na direção normal?

 

R: Geralmente, as colunas de fase normal e de fase reversa podem ser limpas por retrolavagem. Mas a retrolavagem não pode ser usada em colunas que apresentam frita de entrada e saída com tamanho de poro assimétrico, colunas fabricadas desta maneira são incomuns nos dias atuais. A retrolavagem visa retirar os contaminantes da coluna de maneria fácil e rápida, por isso é melhor usar a coluna na direção normal para evitar contaminação em ambas as extremidades. A maioria das colunas Welch podem ser limpas por retrolavagem, e recomendamos o uso de colunas na direção normal e a limpeza na direção oposta.

 

3

 

P: Alguns fabricantes usam um tamanho de poro maior (2 ~ 5 μm) na frita de entrada para evitar o entupimento, com isso a retrolavagem irá remover material do leito empacotado. O tamanho dos poros das fritas de entrada e saída serão informados nas instruções de uso da coluna ?

 

R: Se o tamanho dos poros das fritas de entrada e saída da coluna forem assimétricos, o fabricante certamente o mencionará nas instruções. O tamanho dos poros das fritas de entrada e saída das colunas Welch é simétrico.

 

4

 

P: A coluna deve ser conectada ao detector durante o retrolavagem?

 

R: O retrolavagem significa conectar a coluna ao sistema na direção oposta. Teoricamente, a coluna pode estar conectada ou desconectada do detector. No entanto, durante a retrolavagem, todo o material particulado retido pela frita da coluna irá se movimentar no caminho fluídico e caso o detector esteja conectado, corre-se o risco aumentado de entupimento de partes sensíveis do detector. Por esta razão, é recomendado não conectar o detector durante a retrolavagem e colocar a tubulação de saída da coluna diretamente no seu descarte de solventes.

 

5

 

P: Ao usar a coluna de troca iônica para fazer o desenvolvimento analítico de uma metodologia, e acetonitrila (ACN) e água ​​como fase móvel, verificou-se que RT (tempo de retenção) é de 2,5 minutos com 60% de ACN e o RT permanece o mesmo com 30% ou 40% de ACN; mas o RT repentinamente muda para cerca de 13 minutos com 20% de ACN durante o processo de ajuste do gradiente. Qual é o motivo?

 

R: O mecanismo de retenção das colunas de troca iônica é principalmente a interação eletrostática. Os principais fatores de influência incluem força iônica, pH, interação secundária de ligações de hidrogênio e exclusão molecular. Portanto, na cromatografia de troca iônica, o mecanismo de retenção não é tão simples quanto a cromatografia de fase reversa, nem sua atuação é clara somente alterando a proporção da fase orgânica. É necessário considerar se o aumento da proporção de fase aquosa leva à mudança da força iônica da fase móvel ou aumenta as interações das pontes de hidrogênio. Além disso, se a matriz da coluna de troca iônica é sílica gel ou polimérica, temos também tem efeitos diferentes.

 

 

6

 

P: Para uma coluna C18 usada em minha rotina, como ativar e manter esta nova coluna? Por que eu deveria ativar uma coluna nova ?

 

R: A ativação da nova coluna é na verdade um processo de equilíbrio. Durante o transporte e armazenamento da coluna, o solvente na coluna pode volatilizar, resultando em um leito empacotado seco. Como a fase ligada não está totalmente “molhada”, a coluna precisa ser ativada. As colunas Welch podem ser ativadas de acordo com as instruções. Além de equilibrar com a fase móvel, às vezes é necessário equilibrar a nova coluna com as amostras testadas. O método de equilíbrio específico também é muito simples, basta aumentar a concentração da amostra injetada ou fazer múltiplas injeções enquanto a eluição não estiver completa. O objetivo de equilibrar uma nova coluna é saturar a capacidade de adsorção dos sítios ativos presentes na superfície do leito empacotado de sílica com adsorção não específica.

 

7

 

P: A coluna C18 será ativada com metanol utilizando fluxos baixos. Qual é o propósito disso?

 

R: A coluna C18 será ativada com metanol utilizando fluxos baixos, pois a solução de armazenamento pode volatilizar no processo de armazenamento e transporte. A baixa taxa de fluxo de metanol pode infiltrar-se bem na fase estacionária, fazendo com que a fase ligada se estique bem. Depois de equilibrar o sistema com solvente, o cromatograma pode ser obtido mais rapidamente por múltiplas injeções ou aumentando o volume da injeção. Desta forma, os sítios ativos na coluna podem saturar com amostras para evitar fenômenos anormais.

 

8

 

P: Eu tinha acabado de instalar uma nova coluna C18 outro dia e lavei com metanol 100% por mais de meia hora antes da injeção. Se eu só lavar meia hora e começar a usar, tudo bem? Isso afetará o pico?

 

R: Em primeiro lugar, se for apenas a ativação de uma nova coluna, recomenda-se seguir rigorosamente as instruções do fabricante; em segundo lugar, nem todas as determinações requerem saturação da coluna nova. No entanto, é um bom hábito injetar várias vezes de acordo com o método e iniciar a determinação formal após garantir que o tempo de retenção do pico de interesse esteja estável.

 

9

 

P: Quais colunas são geralmente usadas para a determinação de peptídeos? Se a fase móvel inclui acetonitrila, água e um pouco de TFA (ácido trifluoracético), ou preciso analisar peptídeos de cadeias curtas, que coluna devo escolher?

 

R: Os polipeptídeos com baixo peso molecular podem geralmente ser determinados por colunas convencionais C18 ou C8, bem como colunas de troca iônica e colunas hidrofílicas HILIC. Se a fase móvel contiver aditivos ácidos, como ácido trifluoroacético, é recomendável usar colunas que resistem a pH baixo, como as colunas da série Ultisil® LP.

 

10

 

P: Quando a coluna amino (NH2) entra em contato com amostras acidificadas, isso pode danificar a coluna. Se a forma do pico mudar depois de usar a coluna por um curto período de tempo, o que devo fazer para manter a coluna?

 

R: Se você usar uma coluna amino (NH2) para determinar amostras acidificadas, o modo HILIC da coluna amino pode ser usado. Os ácidos podem protonar grupos funcionais amino ligeiramente carregados negativamente, resultando em alterações nas propriedades de retenção de alguns analitos ou diminuição da eficiência da coluna após o uso da coluna por um curto período de tempo. Sugestão: enxágue a coluna com 5 ~ 10 vezes o volume da coluna contendo 0,5 ~ 1,0% de NH3 numa solução acetonitrila / água (50/50, depois disso, lave o excesso de amônia com fase móvel livre de álcali). Um pouco de amônia, como 0,05%, é recomendado para ser adicionado na fase móvel ao analisar este tipo de analitos acidificados.

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 Artigos Welch / Chromastore   artigo 26NOV21 Traduzido por Ronaldo Buissa Netto

Qual é o uso adequado da água na fase líquida ?

Como todos sabemos, a água é um dos solventes mais comumente usados em experimentos em fase líquida, como água purificada, água destilada, água ultrapura etc. Mas será que realmente sabemos como escolher a água certa? 

Estrutura Básica da Água

Uma molécula de água (H2O) é formada pelas ligações covalentes de um átomo de oxigênio ligado a dois átomos de hidrogênio. Estas ligações covalentes entre oxigênio e hidrogênio tornam a molécula de água polarizada. Quando duas moléculas de água coexistem, elas se combinam por interação eletrostática com ligações de hidrogênio para se atrair e manter uma certa distância. Enquanto uma molécula de água pode se combinar com quatro moléculas de água ao mesmo tempo para formar uma estrutura cristalina. 

Possíveis impurezas na água

Substâncias inorgânicas solúveis: sais inorgânicos, gases dissolvidos, metais pesados, componentes de dureza (cálcio, magnésio, etc);

Matéria orgânica solúvel: lignina, tanino, ácido húmico, endotoxina, enzima de decomposição de RNA, pesticida, triclorometano, hormônio ambiental, agente ativo interfacial (tensoativos / surfactantes), solvente orgânico;

Micropartículas: ferrugem, colóide, suspensões, partículas sólidas;

Microorganismos: bactérias, algas. 

O que há na água?

1. Partículas

As partículas desgastam as bombas, especialmente selos e pistões. Para nossos injetores, as partículas também os desgastam (entupimentos e riscos nos selos de rotor, por exemplo). Além disso, as partículas bloquearão colunas e tubos, resultando em aumento da pressão. As partículas também se comportarão como outra fase estacionária que pode alterar a composição das amostras.

2. Compostos orgânicos

 Os compostos orgânicos na água ultrapura podem afetar a resolução do pico, levando a picos fantasmas. Também pode alterar a seletividade da fase estacionária e afetar a linha de base cromatográfica.

3. Íons

A mudança na concentração de íons afetará o resultado da separação, e alguns íons que absorvem luz ultravioleta afetarão o pico também. Alguns íons corrosivos até reduzem a vida útil das bombas de infusão de alta pressão e outros acessórios.

4. Coloide

Os coloides serão adsorvidos irreversivelmente na fase estacionária, afetando a resolução das colunas.

5. Microrganismos

Os micróbios bloquearão as colunas e seus metabólitos aumentarão os compostos orgânicos, as partículas e outros poluentes.

Água comumente utilizada no laboratório

 

A água comumente utilizada no laboratório é: água purificada, água deionizada e água ultrapura.

 

Água purificada: 

Com o nível mais baixo de purificação, sua condutividade é geralmente entre 1 - 50μs / cm. Pode ser obtida por osmose reversa ou destilação única de resina de troca aniônica fracamente básica. As aplicações típicas incluem limpeza de vidraria, autoclave, câmaras climáticas e / ou água usada na máquina de limpeza de vidrarias. 

Água deionizada: 

A condutividade é geralmente entre 1,0 – 0,1 μs / cm. É obtida por troca iônica de leito misto com resina de troca aniônica forte. Possui nível relativamente alto para limpeza de contaminação orgânica e bacteriana, que pode atender a uma variedade de necessidades, como limpeza, preparação de amostras para padronização analítica, preparação de reagentes e diluição de amostras.  

Água ultrapura: 

Este nível de água ultrapura está próximo do limite teórico de pureza em termos de resistividade, conteúdo orgânico, partículas e conteúdo bacteriano. Normalmente iniciamos a purificação por troca iônica, membrana de osmose reversa ou destilação, então obtemos a água ultrapura por purificação por troca iônica. Geralmente, a resistividade da água ultrapura pode atingir MΩ.18,2 cm, TOC <10 ppb. Se filtrar 0,1 μm ou partículas menores, o conteúdo bacteriano pode ser inferior a 1 CFU / ml. Água ultra-pura é adequada para vários tipos de experimentos de análise de precisão, como cromatografia líquida de alta performance (HPLC), cromatografia de íons (IC) e espectrometria de massa de captura de íons (ICP-MS).

  

Coluna Ghost-Buster II

 ● Processo de embalagem otimizado, método de produção aprimorado, melhor efeito de captura e maior tolerância;

 ● Desenho do produto ainda mais atualizado, reduz muito as oscilações de linha de base durante a estabilização do sistema cromatográfico, minimiza inclinação de linha de base e outras situações;

 ● Mais compatível com gradientes com alta proporção de fase aquosa para diminuir o tempo de execução do gradiente total e linha de base mais estável.

P/N	Produto	Especificação	Presssão Máxima
06100-31008	Coluna Ghost-Buster Ⅱ	4.0 × 50 mm	400 bar / 5800 psi
06100-31016	Coluna Ghost-Buster Ⅱ	3.0 × 50mm	400 bar / 5800 psi

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Guia para escolha de vials

 

Você já parou para pensar o quão importante é a escolha correta dos seus vials para os amostradores automáticos dos seus instrumentos analíticos ?

Sabemos que o custo de um vial é insignificante perto dos valores gastos com instrumentação analítica, manutenção, contrato de serviços, etc, mas isso não quer dizer que não temos com o que se preocupar quando falamos deste consumível tão importante para a rotina do seu laboratório.

O conjunto de consumíveis utilizados para conter sua amostra dentro do amostrador automático é composto por vial, tampa, septo e em alguns casos, insert.

O que devemos considerar quando escolhemos o vial para seu amostrador automático ?

Compatibilidade com o amostrador: nem todos os amostradores são iguais. Alguns trabalham com braços robóticos para pegar o seu vial; outros utilizam de carrosel ou bandejas que se movem até a agulha de injeção; em outros modelos, a agulha vai até o sua amostra; alguns amostradores possuem um pegador magnético para mover seu vial até a agulha de injeção. As dimensões dos vials também podem variar de acordo com o fabricante do amostrador. A maioria deles trabalha com vials 12 x 32 mm. Sempre consulte o manual do usuário de seu amostrador para escolher as dimensões de seu vial.

Volume de amostra: a quantidade de amostra disponível é fator primordial na escolha correta do seu vial. Se você tem uma quantidade limitada de amostra disponível, você deverá escolher entre usar um insert dentro do seu vial, usar um micro vial ou até um vial de alta recuperação.

Compatibilidade dos componentes do vial com a amostra: a compatibilidade entre analito e solventes deve ser considerado quando estamos escolhendo o vial e seus acessórios. Por exemplo, se sua amostra é sensível à luz, um vial âmbar deve ser utilizado; um vial de plástico é indicado quando sua amostra interage com o vidro, para cromatografia de íons, AA, ICP MS ou eletroforese capilar. A composição do vidro é outro importante ponto quando falamos de inerticidade química: a USP classifica as vidrarias de laboratório de acordo com sua resistência ao ataque de água. Coeficiente linear de expansão é outro parâmetro a se considerar: quanto menos seu coeficiente, melhor o vidro pode suportar as mudanças de temperatura sem se fraturar. Vials silanizados ou desativados passam por um tratamento químico que tornam sua superfície mais hidrofóbica e inerte, sendo indicados para amostras mais sensíveis como semivoláteis e pesticidas.

Tampas: as tampas podem ser encontradas com rosca, lacrável (crimp) e encaixadas (snap). Tampas rosqueáveis oferecem baixa evaporação, reutilização e menores riscos de ferir as mãos no uso do lacrador / deslacrador. Tampas lacráveis oferecem a melhor vedação mas são descartáveis. Já as tampas encaixadas oferecem praticidade por serem rápidas pra abrir e fechar os vials, mas só são indicadas para amostras não voláteis pois sua vedação não é tão eficiente como as tampas rosqueáveis e lacráveis.

Septos: os septos são fabricados de diferentes materiais e possuem mais de uma camada. É importante verificar a compatibilidade do seu septo com a amostra e os solventes utilizados. Existe a opção de dos septos pré cortados, que mantém o equilíbrio de pressão interna e externa, além de facilitar a penetração pela agulha do amostrador; indicados para amostras não voláteis e para injeções de grande volume proporcionalmente ao volume do vial (1 injeção de 800 uL num vial de 2 mL).

Inserts: é um acessório muito utilizado quando a quantidade de amostra é um fator limitante para o cliente. O formato e o volume são importantes parâmentros no escolha correta do seu insert. Os inserts de fundo chato possuem maior volume, mas em contrapartida apresentam o maior volume residual. Já os inserts cônicos possuem volumes menores, mas seu formato proporciona um aproveitamento máximo do volume de amostra.

Outros acessórios

Lacrador / Deslacrador manual ou eletrônico: ferramenta obrigatória para selar seus vials utilizando tampas lacráveis. Cuidado com aperto excessivo, que podem causar a quebra do vial e o tensionamento do septo, que pode entortar a agulha do seu amostrador automático.

Vials com insert integrado: podem ser fabricados em vidro ou plástico, são uma solução prática para usuários com volume limitado de amostra, pois não é necessário inserir o insert dentro de cada um dos vials a ser utilizado durante a análise.

Vials de alta recuperação (volume residual mínimo): este tipo de vial apresenta o fundo cônico, facilitando a retirada de pequenos volumes. Indicado aos usuários com volume de amostra limitada.

Problemas causados pela escolha errada de vials e acessórios:

- picos fantasmas devido a interações do analito e / ou solvente com vial e / ou septo;

- interferência com os analitos de sua amostra, causado pela interação de seus analitos com o vidro borosilicato de baixa qualidade, com o vial plástico ou com as camadas do septo;

- perda de analitos ou concentração de analitos devido à evaporação de solventes ou do próprio analito de interesse, causado pela má vedação do conjunto vial + tampa + septo;

- danos físicos ao seu amostrador, causados por vials / inserts com dimensões erradas ou com deformação na sua construção (paredes finas demais podem causar a quebra, ou fundo irregular são alguns exemplos), septos muito tensionados (risco de entortar a agulha do seu amostrador automático);

- degradação de sua amostra, devido à má vedação ou interações com vial / insert / septo de má qualidade;

- baixa reprodutibilidade de suas injeções, causado pela evaporação de amostra e / ou solventes.

Dicas práticas:

- quando comprando vials, não mantenha sua atenção no volume máximo, que pode variar de 1,5 mL à 2 mL dependendo de onde o fabricante mede este limite; se atente às dimensões do vial (altura, diâmetro e largura do pescoço);

- ND ou N: muitos fabricantes ou revendedores trazem esta informação na descrição do vial (ND9, N8, etc). Isso significa que o diâmetro do pescoço é 9 mm, 8 mm, etc. Esta é sim uma informação crucial no momento da compra. Vials ND8 ou N8 são conhecidos como vials de boca estreita; vials ND9 ou N9 como vials de boca larga; vials ND11 ou N11 são os vials compatíveis com tampas lacráveis ou encaixadas;

- opte pelos vials de rosca curta (425), pois vedam muito bem mas diminuem o tempo de rosqueamento em até 30%;

- lembre se que quando você utiliza um insert ou um vial com insert integrado, você está mudando a altura do fundo do seu vial, e dependendo do tipo de amostrador que você está utilizando, a agulha deste pode encostar no fundo do vial ou insert, causando irreprodutibilidade entre as injeções e nos piores dos casos até entortar a agulha ou mesmo a quebra do vial no momento da injeção ; vá no software de controle do seu injetor automático e ajuste a altura de coleta da agulha.

HPLC na prática - parte 5: Colunas dedicadas

 

Não há nada mais frustrante para um cromatografista do que chegar no dia seguinte em frente do seu HPLC e perceber que aquela sêquencia colocada pra rodar no dia anterior foi perdida.

Não importa se era um teste, 5 lotes de produto final, estabilidade ou uma validação de método, aquele instante da descoberta é frustrante e a única coisa que queremos saber é o que causou o problema.

Em geral procuramos por erros grandes para justificar o problema: uma coluna saturada, uma fase móvel preparada errada ou um defeito no equipamento.

Mas na maioria das vezes não encontramos o tal “problema”, e dependendo do nível de compliance da empresa em que você atua, alguns dias serão perdidos tentando justificar o erro, sem encontrar o real motivo para o problema.

O que muitos usuários de cromatografia líquida ainda não perceberam é que em geral, este “problema” grande que estamos procurando nada mais é do que a somatória de pequenos erros gerados na nossa rotina de preparação do sistema HPLC para aquela análise.

Nos próximos posts iremos tratar em detalhes quais são os cuidados que os cromatografistas experientes

utilizam em sua rotina para garantir uma rotina produtiva e confiável.

Colunas dedicadas: para alguns segmentos do mercado, falar em coluna dedicada é redundância, mas esta não é a realidade de todo o mercado de cromatografia.

Laboratórios de prestação de serviços não fazem sempre a mesma análise, mas sim o que o cliente precisa e quase sempre não é uma única metodologia.

Empresas de médio e pequeno porte não possuem grandes orçamentos para manter 20 ou 30 colunas para cada um dos seus produtos, por isso compartilham as colunas entre métodos.

Mas por que ter colunas dedicadas irá melhorar a eficiência da minha rotina cromatográfica ?:

    - a durabilidade de uma coluna dedicada normalmente já é     conhecida, pois temos o histórico daquela análise, e por esta     razão já sabemos que uma dada coluna dura 500, 1000 ou 3000  injeções, e isso utilizado junto com o livro de registro analítico é  ferramenta importante para sabermos quando uma coluna vai   falhar numa adequabilidade de sistema e nos precavermos   trocando a coluna antecipadamente;

    - o número de interferentes e o tipo deles também já é conhecido numa coluna dedicada, o que não causa surpresas entre rotinas diferentes, ou seja, um contaminante do método A pode coeluir com um analito do método B rodado na mesma coluna, causando perda de tempo e de produtividade;

    - as colunas dedicadas duram mais facilitam o cálculo do custo analítico, pois tenho um melhor controle da vida útil da coluna. Por exemplo: um método A tem uma coluna com vida útil média de 3000 injeções, já a coluna do método B dura por volta de 500 injeções; se cada análise minha consome 50 injeções (método A e B - hipotético para efeito de cálculo),  numa coluna dedicada eu teria uma coluna durando 60 análises pro método A e pro método B a coluna dedicada duraria 10 análises. Como eu teria certeza do custo analítico numa coluna compartilhada ?

- em colunas dedicadas o tempo gasto com equilíbrio e limpeza é menor ou pelo menos mais eficiente: se seu método foi bem desenvolvido, parte desse desenvolvimento focou na limpeza da coluna, baseado nos tipos de modificadores utilizados, nos diferentes interferentes presentes naquela matriz, entre outros pontos importantes. Com isso, a limpeza após o uso da coluna é sempre o mesmo, dando maior previsibilidade com relação ao tempo gasto com aquela análise, cálculos como hora / máquina, hora / homem, hora / análise, etc.

Dicas práticas:

    - coluna é um consumível, vai gastar e acabar, por                            isso utilize ferramentas pra prever este fim e evitar perda         de tempo e produtividade;

- o custo de uma coluna para uma análise é relativamente baixo, quando comparado ao custo com outros consumíveis, como por exemplo SPE; não perca tempo tentando rodar uma análise com uma coluna com pratos teóricos comprometidos, troque por uma nova e previamente equilibrada e em paralelo tente limpar e / ou regenerar a coluna velha;

- mantenha registros de sua coluna: muitos usuários possuem logbook de equipamentos, mas não possuem logbook de colunas. Um registro básico com inormações como pressão, pratos teóricos, resolução e outros parâmetros cromatográficos nos ajudam a ter uma idéia bastante precisa das condições de nossa coluna;

- sempre mantenha o cromatograma das primeiras injeções como referência: uma simples comparação entre os formatos de pico da coluna nova e seu estado atual já eliminam a perda de tempo com tentativas de rodar adequabilidade de sistemas, injeções teste, etc.